（5）抗菌成分的胰蛋白酶水解作用試驗

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進無菌檢測細胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進4個無菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時用鹽水做為對比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究抗菌試驗中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種CFS，各自調(diào)整pn為胰蛋白酶K、胃蛋白酶和蛋白酶的適宜功效pH，按1.0mg／mL各自添加胰蛋白酶K(適宜pH7.0)、胃蛋白酶(適宜pH2.0)、蛋白酶(適宜pH7.0)，37℃下溫育1h，將CFS的pH調(diào)返回5.0，牛津杯法精確測量其抑菌圈直徑，反復(fù)3次，以沒經(jīng)胰蛋白酶解決過的pH=5.0的CFS為對比。認證乳酸菌飲料CFS的抗菌活性物質(zhì)是不是為蛋白質(zhì)類。

（6）乳酸菌飲料組織學(xué)特點觀查

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進無菌檢測細胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進4個無菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時用鹽水做為對比。抗菌試驗中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種注射于MRS固態(tài)平板電腦上四劃分線，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h，觀查固態(tài)平板電腦上的菌體形狀特點并挑菌單菌體開展革蘭氏染色試驗，鏡檢查觀查菌體上色結(jié)果和組織學(xué)特點。

（7）菌種鑒定

①生理學(xué)生物化學(xué)評定試驗

參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中的實驗方法，選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進無菌檢測細胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進4個無菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時用鹽水做為對比?？咕囼炛幸志^大的乳酸菌飲料菌種開展生理學(xué)生物化學(xué)評定。

②16SrRNA遺傳基因保守序列增加

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進無菌檢測細胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進4個無菌檢測牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時用鹽水做為對比。

將抗菌試驗中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開展病菌基因的獲取，依照已買病菌DNA獲取檢測試劑盒使用說明試驗操作流程開展。

③菌種鑒定并搭建系統(tǒng)軟件進化樹

取5μL增加精彩片段100V工作電壓下，1％瓊脂糖電泳原理觀查結(jié)果(尺寸應(yīng)是1500bp上下)。認證后的電泳條帶膠回收利用檢測試劑盒回收利用，回收利用物質(zhì)送上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測序。將菌種16SrRNA高通量測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫查詢中已經(jīng)知道菌種保守序列開展核對，根據(jù)MEGAX手機軟件剖析目地基因序列的開放閱讀框，并搭建系統(tǒng)發(fā)育樹。

4、數(shù)據(jù)處理方法

每一個試驗3個平行面，數(shù)據(jù)信息用x^–±s表明。

二、結(jié)果與剖析

1、乳酸菌飲料菌種分離出來

從安徽省當(dāng)?shù)厮岵酥袊伯a(chǎn)黨分離出來得到10個溶鈣圈的乳白色單菌體，經(jīng)初始評定得到6株乳酸菌飲料，進一步挑選提純后依照菌種來源于和挑菌次序取名。

2、抗菌試驗結(jié)果

抗菌試驗結(jié)果如圖所示1所顯示，菌種PC-3對2種指示菌抑菌圈直徑較大，抗菌實際效果最好是，對大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自做到17.17 0.42mm和19.23±0.61mm。結(jié)果顯示該菌種對大腸埃希菌和金黃鏈球菌有極強的殺菌作用。緣故可能是乳酸菌飲料在成長新陳代謝的環(huán)節(jié)中形成了有機物、H₂0₂或病菌素，進而控制了標(biāo)示病菌的生長發(fā)育。挑選PC-3號菌種做為事后試驗菌種。

3、菌種PC-3生長曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖的測量

菌種PC-3生長曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖如圖2所顯示，該菌種在0～12h處在延滯期，生長發(fā)育遲緩，延滯期相比較長。菌種PC-3在12h后進到對數(shù)期，菌體細胞快速繁衍生長發(fā)育，在36h菌體細胞數(shù)做到最高值。在菌體進到多數(shù)成長期后菌液的pH快速減少，穩(wěn)定型時pH保持在4.0上下。
 

4、有機物和雙氧水清除抗菌試驗結(jié)果

菌種PC-3CFS對二種指示菌的抑制效果，可能是菌種PC-3新陳代謝生成的病菌素或酸堿性尾端物質(zhì)如有機物或雙氧水功效的結(jié)果。如圖所示3所顯示，pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實際效果對比，對大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自降低了7.0％和6.6％，表明pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實際效果相仿，事后實驗中抗菌實際效果比較能夠 pH=5.0做為pH調(diào)整標(biāo)準；pH=5.0的乳酸菌和甲酸對照實驗對二種指示菌的抑菌圈直徑顯著減少，抗菌實際效果非常明顯變?nèi)酰砻髑宄樗峋图姿岬挠绊懞?，CFS中還出現(xiàn)別的抗菌化學(xué)物質(zhì)，菌種PC-3CFS中起關(guān)鍵殺菌作用的化學(xué)物質(zhì)并不是有機物類。