做為一種必不可少的營養(yǎng)元素，鋅對身體的發(fā)育和免疫力作用的健全特別是在關(guān)鍵。因為身體沒有專業(yè)的鋅貯藏點，人體必須 根據(jù)日常飲食附加填補充分的量來維系身體鋅的平衡狀態(tài)。現(xiàn)階段全球資本主義國家中大概有2兩億人口數(shù)量遭受鋅缺少的危害，尤其是寶寶、孕媽媽、哺乳期間的女生及其老人受影響最比較嚴(yán)重。因而，推動飲食中鋅的消化吸收變成當(dāng)今營養(yǎng)成分分析的網(wǎng)絡(luò)熱點。

鋅在人體內(nèi)的溶出度非常大水平上在于其在結(jié)腸內(nèi)的消化吸收。食材栽培基質(zhì)中的成份，比如植酸、花青素、人參皂甙和膳食纖維等，會與鋅融合產(chǎn)生不可溶的一氧化氮合酶，進而阻攔鋅的消化吸收，造成身體鋅欠缺。食材中別的礦物，如鐵、鈣、碘離子也會競爭地與媒介融合而抑止鋅的消化吸收。根據(jù)填補碳酸鹽(ZnSO₄，ZnO)是一種普遍的防止鋅缺少的方式，可是含鐵的碳酸鹽不但會變化食材的物理化學(xué)和感觀特性，還會繼續(xù)造成消化道不適感，不適合長期性攝取。相關(guān)食源性活性多肽做為配位與鋅融合，進而提升 鋅的吸附在世界各國已經(jīng)有科學(xué)研究，活性多肽被覺得是一類十分有潛能的推動鋅消化吸收的化學(xué)物質(zhì)。opo結(jié)構(gòu)脂是牛乳中的關(guān)鍵蛋白，約占總蛋白的80％，是多種多樣生物活性肽的來源于；在其中，opo結(jié)構(gòu)脂磷酸肽早已被證實可以與鋅融合，而且具備不錯的促鋅消化吸收實際效果?？墒且驗殡囊讳\螯合物在消化道內(nèi)可靠性的難題，造成 鋅的消化與在身體的微生物使用率有較大差別。由于鋅離子含有正電，肽的構(gòu)造特性尤其是正電荷特性(正負(fù)極性和凈電荷量)，根據(jù)靜電感應(yīng)相互影響，對其鰲合鋅離子的功能及其螯合物在消化道內(nèi)的穩(wěn)定尤為重要，會影響到鋅的最后消化吸收和微生物使用率。可是，現(xiàn)階段有關(guān)肽的正電荷性對肽一鋅螯合物在消化道內(nèi)消化和吸收危害的體系科學(xué)研究欠缺報導(dǎo)。

因而，本試驗以opo結(jié)構(gòu)脂為原材料，經(jīng)堿性蛋白酶水解反應(yīng)后選用陽離子交換色譜層析分離opo結(jié)構(gòu)脂肽，并制取肽-鋅螯合物。試驗中對分離出來獲得的opo結(jié)構(gòu)脂肽的掌電勢差及其碳水化合物構(gòu)成開展測量，與此同時選用身體之外胃酸-腸液-Caco-2體細(xì)胞的三段式消化模型模擬肽-鋅螯合物的腸胃消化和吸收，以鋅離子的分析率是關(guān)鍵評定指標(biāo)值，調(diào)查肽的正電荷特性對肽-鋅螯合物腸胃消化吸收可靠性和鋅微生物使用率的危害，結(jié)果有希望為opo結(jié)構(gòu)脂肽在補鐵保健品企業(yè)的使用給予參照。

一、試驗原材料與機器設(shè)備

1、試驗原材料

opo結(jié)構(gòu)脂(商品編號：C3400)，堿性蛋白酶(Alcalase，P4860=2.4U/g)，胃蛋白酶(P7000=250U/mg)，胰酶(P1750，4XUSPspecifications)，異硫氰酸苯酯(PITC，P1034)，三乙胺(Triethylamine，T0886)，17種碳水化合物混和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AASl8)選購于Sigma企業(yè)；高糖高熱量培養(yǎng)液(DMEM)，胎牛血清(FBS)，非必須氨基酸(NEAA)，青霉素鈉-氨芐青霉素溶液，HBSS(Hank’Sbufferedsalinesolution)，胰酶-EDTA選購于Hyclone公司(ThermoScientific)；25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc)，6孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc，直徑0.4μm，總面積4.2cm²)，透析袋選購于北京索萊寶企業(yè)；ZORBAXSB-C18色譜柱(250×4.6mm，安捷倫)；SephadexC25疑膠柱層析填充料，選購于GEHealthcare生物科學(xué)有限責(zé)任公司；Caco-2體細(xì)胞，選購于中科院上海細(xì)胞庫；別的實驗試劑均為分析純，購于國藥控股化學(xué)藥品有限責(zé)任公司。

2、實驗室儀器

LC-15高效率液相色譜、AA-7000原子吸收光度計，購于安捷倫儀器進出口貿(mào)易(上海市)有限責(zé)任公司；HZS-HA恒溫水浴槽震蕩器、DL-CJ-1N凈化工作臺，購于哈爾濱市東聯(lián)電子器件科研開發(fā)有限責(zé)任公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購于上海亞榮生物化學(xué)儀器廠；BT-100B數(shù)顯式恒流泵、HD-5電腦上紫外線檢查儀、HD-A電腦上數(shù)據(jù)采集器，均購入于青浦區(qū)滬西儀器廠；Nano-ZS90納米技術(shù)粒度分布電位差儀，選購于美國Malvem企業(yè)；Infinite200Pro多用途酶標(biāo)儀，選購于法國TecanTradingAG；3111型二氧化碳恒溫箱，購于ThermoScientific；LGJ-18冷凍式干燥機，購于北京四環(huán)科學(xué)研究儀器廠。

二、實驗方法

1、opo結(jié)構(gòu)脂水解反應(yīng)

將opo結(jié)構(gòu)脂固態(tài)粉末狀溶解雙蒸水中，使其含量為5％(w/v)，用0.5MNaOH調(diào)整pH為8.0，將opo結(jié)構(gòu)脂水溶液在60℃水浴中加熱10min。接著向在其中加上堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的增加量為opo結(jié)構(gòu)脂品質(zhì)的2％，在60℃水浴搖床中酶解4h，在酶解全過程中運用0.0lMHCI和0.5MNaOH操縱水解反應(yīng)液pH為8.0。酶解完畢后，將水解反應(yīng)液燒開滅酶15min，制冷至常溫后，用0.01MHCI和0.5MNaOH調(diào)pH至7.0，接著在4℃8000r/min標(biāo)準(zhǔn)下離心式15min，隨后取上清液濃縮后低溫干燥，-80℃超低溫儲存。

2、opo結(jié)構(gòu)脂肽的分離出來

將以上制取獲得的opo結(jié)構(gòu)脂水解反應(yīng)物復(fù)溶解20mM，pH4.0的冰醋酸緩沖液中，使其含量為400μlg/mL，充足融解后，選用0.45μm水系濾膜過慮，滲瀝液經(jīng)SephadexC25疑膠柱層析開展分離出來。在0～120min內(nèi)，選用冰醋酸緩沖液(20mM，pH4.0)做為過柱液開展過柱；120～240min內(nèi)，選用冰醋酸緩沖液(20mM，pH4.0) 0.5MNaCI做為過柱劑完成過柱。全部過柱全過程中，操縱隔膜泵的水流量為3.0mL/min。過柱液選用紫外線探測器檢驗，光波長為220nm，選用系統(tǒng)軟件內(nèi)置的HD-A色譜儀解決系統(tǒng)軟件紀(jì)錄分離出來流程中圖普的轉(zhuǎn)變，依據(jù)檢測到的試品峰開展試品搜集。搜集獲得的opo結(jié)構(gòu)脂肽成分經(jīng)轉(zhuǎn)動蒸發(fā)濃縮后，低溫干燥，一80℃遮光儲存。

3、opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的ζ電勢差測量

opo結(jié)構(gòu)脂肽成分ζ電勢差選用電位差檢測儀開展測量。opo結(jié)構(gòu)脂肽溶解雙蒸水中，充足混合后使其含量為1mg/mL。接著運用納米技術(shù)粒度分布電位差儀對分離出來獲得opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的ζ電勢差開展測量，剖析時毛細(xì)血管試品池需在25℃標(biāo)準(zhǔn)下均衡120S。

4、碳水化合物構(gòu)成剖析

精確稱量2g被測試品于具塞試管刷中，隨后添加2.0mL6M的硫酸，接著在110℃烘干箱中開展全水解反應(yīng)24h。水解反應(yīng)完畢后，在40℃烘干箱中烘干處理。接著用雙蒸水開展融解，使其含量為2mg/mL，取200此于深棕色瓶中，向在其中加上100μL0.1M的異硫氰酸苯酯和100μL1M的三乙胺，漩渦震蕩后，置放于室內(nèi)溫度黑喑情況下反映1h。反映完成后，向以上反映系統(tǒng)中添加400μL正己烷，漩渦震蕩攪拌，靜放10min后汲取下一層液態(tài)，過0.22μm水系濾膜后開展高效液相色譜色譜。高效液相標(biāo)準(zhǔn)如下所示，流動性相A：10mM，pH6.9的磷酸緩沖液；流動性相B：乙腈。過柱梯度方向：1～5min，5～10％B；5～25min，10～21％B；25～45min，21～35％B；45～48min，35～100％B；48～50min，100％B；50～58min，100～5％B；58～60min，5％B。

流動速度：1.0mL/min，檢驗光波長：254nm，進樣量：5μL。選用與以上同樣的辦法對碳水化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展測量，隨后以濃度值對峰總面積做出碳水化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖。每一種碳水化合物的成分表明成g/100g。

5、鋅鰲合工作能力測量

opo結(jié)構(gòu)脂肽的鋅鰲合工作能力的測量參照J(rèn)akob等的方式 。將試品溶解40mM羥乙基哌嗪乙磺酸-KOH緩沖液中(pH7.5)，使其含量為1Mg/mL。取250mL試品水溶液與125μL8mM的二硫蘇糖醇和125μL250μM的ZnS0₄ 7H20混和，充足攪拌后在37℃標(biāo)準(zhǔn)下反映10min，接著向當(dāng)中添加25μL2mM的4-(2-吡啶甲酰胺)間苯二酚，攪拌后在500nm處測量吸光度值。與此同時以不用opo結(jié)構(gòu)脂肽試品做為空缺組，以EDTA做為呈陽性對照實驗開展實驗。鋅鰲合工作能力的計算方法如下所示：

C=[(A_空缺一A_試品)/A_空缺]×100。

6、肽-鋅螯合物的制取

將ZnS0₄·7H₂0溶解pH7.0的聚磷酸鹽緩沖溶液中，濃度值為50μM，接著將opo結(jié)構(gòu)脂肽溶解以上水溶液中，使其終濃度值為10mg/mL，攪拌后，在常溫下混合反映1h。接著，用分子結(jié)構(gòu)截流量為500Da的透析袋分析5h，除去反映液中的分散鋅，搜集透析袋內(nèi)的保存物低溫干燥后獲得肽-鋅螯合物。