阿爾泰金銀花（Trolliusaltaicus），為毛茛科金銀花屬多年生長(zhǎng) 木本植物，關(guān)鍵發(fā)育于在我國新疆阿勒泰、塔城地區(qū)，性微寒，具備清熱去火、消腫除菌、止血方法止咳化痰等作用，其干躁花骨朵臨床醫(yī)學(xué)上多用以上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃體發(fā)炎等癥狀的醫(yī)治，本地民俗也將其泡茶食用以預(yù)防流感等病癥。殊不知，做為產(chǎn)品金銀花的來源于中藥材之一，該中藥材的分析報(bào)導(dǎo)較少。葒草素半乳糖苷等黃酮類碳苷類物質(zhì)是該中藥材充分發(fā)揮藥力的關(guān)鍵活力成份，并進(jìn)一步討論了其黃酮類物質(zhì)的流回獲取加工工藝。超聲波輔助獲取是使用超聲的劇烈的震動(dòng)、空蝕、拌和等效用毀壞植物細(xì)胞壁，推動(dòng)相關(guān)成分溶解獲取有機(jī)溶劑中。酶輔助超聲波獲取法融合了酶法和超聲波獲取法的優(yōu)勢(shì)，不但獲取時(shí)間較短、獲取高效率，且能比較好地維持提取液的特點(diǎn)和質(zhì)量，已經(jīng)被普遍使用于中草藥材活力化學(xué)成分的獲取當(dāng)中。文中擬深入探討酶制劑的類型、酶加上量、pH、料液比、獲取時(shí)間、獲取溫度及其獲取輸出功率對(duì)其所含黃酮類獲取率的危害，進(jìn)一步融合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，提升阿爾泰金銀花黃酮類物質(zhì)的最好酶輔助超聲波獲取加工工藝，為阿爾泰金銀花以及黃酮類物質(zhì)的深度開發(fā)給予參照數(shù)據(jù)信息。

一、原材料與方式

1、原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

阿爾泰金銀花中藥材于2016年8月收集于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆省藥物研究所何江副研究員評(píng)定為阿爾泰金銀花T.altaicus的干躁花骨朵，中藥材破碎，過40目篩。葒草素2-O-β-L-半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（OGA，上海源葉生物技術(shù)有限責(zé)任公司，質(zhì)量濃度98.0%，P31O7F23952）；纖維素酶:（4×10⁵U/g）、半纖維素酶（1×10⁵U/g）果膠酶（3×10⁵U/g）和中性蛋白酶（5×10⁵U/g）各自購自上海市如吉生物技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；別的實(shí)驗(yàn)試劑均為國內(nèi)分析純。

2、儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

AS系列產(chǎn)品超聲波清洗機(jī)：天津市歐特賽恩斯儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；DZKW-S-4電加熱恒溫水浴鍋：北京永光輝醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司；AL204型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，751型紫外線由此可見光度計(jì)：上海市菁華高新科技儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)曲制作

高精密稱量干躁至恒重的OGA標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%酒精融解、稀釋液至標(biāo)尺，混勻、靜放，得0.20mg/mL的0GA標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，儲(chǔ)存預(yù)留。各自高精密汲取標(biāo)準(zhǔn)品水溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL各自放置25mL容量瓶中，各放水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉水溶液1.0mL，攪拌，置放6min后，加10%硝酸鋁水溶液1.0mL，攪拌置放6min后；加上4%氫氧化鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，放水至標(biāo)尺，混勻置放15min，以相對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)試劑為空缺，在500nm處測(cè)量OD值（A），以A為縱軸，濃度值（C）為橫軸制作標(biāo)曲，得線性回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范疇內(nèi)有優(yōu)良的線性相關(guān)關(guān)聯(lián)。

（2）試品水溶液制取以及黃酮類物質(zhì)測(cè)量

稱量一定量阿爾泰金銀花，再各自向在其中加上不一樣容積不一樣含量的酒精，添加酶，在一定溫度下各自超聲波解決一定時(shí)間，制取供試試品水溶液。高精密稱量干躁至恒重的OGA標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%酒精融解、稀釋液至標(biāo)尺，混勻、靜放，得0.20mg/mL的0GA標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，儲(chǔ)存預(yù)留。各自高精密汲取標(biāo)準(zhǔn)品水溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL各自放置25mL容量瓶中，各放水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉水溶液1.0mL，攪拌，置放6min后，加10%硝酸鋁水溶液1.0mL，攪拌置放6min后；加上4%氫氧化鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，放水至標(biāo)尺，混勻置放15min，以相對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)試劑為空缺，在500nm處測(cè)量OD值（A），以A為縱軸，濃度值（C）為橫軸制作標(biāo)曲，得線性回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范疇內(nèi)有優(yōu)良的線性相關(guān)關(guān)聯(lián)。并測(cè)算獲取率。阿爾泰金銀花黃酮類物質(zhì)獲取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C為萃取液中黃酮類濃度值（mg/mL），V為萃取液容積（mL），M為中藥材品質(zhì)（mg）。

（3）酶制劑的挑選

稱量1.0g阿爾泰金銀花若干份，各自向當(dāng)中添加占中藥材品質(zhì)1.0%的纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、中性蛋白酶，將一份沒加一切酶制劑的試品作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每一份試品各自加50倍量50%酒精，添加硫酸緩沖溶液，調(diào)pH各自設(shè)置3、4、5、6，將以上每組試品于40℃，超聲波輸出功率90W下超聲波獲取30min酶解后，每組試品經(jīng)滅酶（開水浴5min），過慮獲得上清液。各自從每組中加入適量萃取液，測(cè)算金銀花黃酮類物質(zhì)獲取率。

（4）單要素實(shí)驗(yàn)

稱量中藥材1.0g，各自對(duì)超聲波酶輔助獲取加工工藝中的影響因素（酶加上量、料液比、獲取溫度、獲取時(shí)間、超聲波輸出功率）開展調(diào)查。酶加上量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇濃度：30%、40%、50%、60%、70%；獲取溫度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；獲取時(shí)間：10min、20min、30min、40min、50min；超聲波輸出功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。

（5）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)Box-Behnken核心組合原理，在單要素實(shí)驗(yàn)效果的根基上，挑選酶加上量、乙醇濃度、獲取時(shí)間和獲取溫度四個(gè)要素為變量，每一變量的實(shí)驗(yàn)各自以-1、0、1編號(hào)，以黃酮類物質(zhì)獲取率（%）為響應(yīng)值，開展四要素三水準(zhǔn)試驗(yàn)，運(yùn)用Design-Expert8.05手機(jī)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)多元化回歸分析和二項(xiàng)式線性擬合，并對(duì)線性擬合方程式開展方差分析。要素水準(zhǔn)設(shè)計(jì)方案見表1。

二、結(jié)果與剖析

1、酶制劑的挑選

不一樣酶制劑在不一樣pH標(biāo)準(zhǔn)下，所得的黃酮類物質(zhì)獲取率都不同樣。伴隨著pH的提升，在各種各樣酶制劑功效下，阿爾泰金銀花黃酮類物質(zhì)獲取率均出現(xiàn)先提高后下降的發(fā)展趨勢(shì)。從圖1能夠看得出，化學(xué)纖維酶在pH相當(dāng)于4時(shí)功效最好是，其獲取率能夠做到17.09%，超過中性蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶、無酶的作用下的獲取率。源液的pH為6.5，因而從獲取率考慮到，更改水溶液的pH為4，且挑選纖維素酶開展下一步實(shí)驗(yàn)。