2.4 PCI2細(xì)胞中的ROS水平及MDA含量

ROS主要來(lái)源于損傷的線粒體，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS或體內(nèi)氧化劑含量超過(guò)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)答能力時(shí)，細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。本試驗(yàn)以DCFH-DA作為熒光探針，檢測(cè)2’，7’-二氯熒光素(DCF)的熒光強(qiáng)度即可獲知細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與空白對(duì)照組相比，90μmol/LH202處理PCI2細(xì)胞4h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加(P＜0.01)，達(dá)到460.43％(圖4a)，使細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷；經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理后，能夠顯著地抑制PCI2細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P＜0.01)，其中2mg/L脂溶性提取物預(yù)處理細(xì)胞8h后，ROS含量為208.37％。熒光顯微鏡觀察染色后的PCI2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)的熒光強(qiáng)度變化與細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化趨勢(shì)一致(圖4b)。因此，脂溶性提取物可以有效地清除ROS，緩解H202引發(fā)的線粒體功能障礙。
 

當(dāng)動(dòng)物或植物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化，而MDA是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，可以用來(lái)確定脂質(zhì)氧化水平。與空白對(duì)照組相比，90μmol/LH₂0₂處理PCI2細(xì)胞4h后，MDA含量顯著增多(P＜0.01)，達(dá)到192.98％(圖5)；經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理8h后，能夠顯著地阻止MDA的產(chǎn)生(P＜0.01)；而正常細(xì)胞經(jīng)脂溶性提取物處理后，在無(wú)H₂0₂傷害的情況下，其MDA含量可降低至25.71％。

2.5 脂溶性提取物對(duì)PCI2細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制細(xì)胞凋亡，利用AnnexinV-FITC/PI進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(圖6a)。如圖6b所示，與空白對(duì)照組(8.14％)相比，H₂0₂處理顯著增加了細(xì)胞凋亡率(23.66％)，經(jīng)朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理后，PCI2細(xì)胞的凋亡得到顯著抑制。其中，經(jīng)過(guò)2mg/L脂溶性提取物預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞凋亡率降低至8.75％。

為了更加直觀地比較不同處理組的細(xì)胞凋亡情況，利用A0-EB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖6c所示，空白對(duì)照組的細(xì)胞因?yàn)檫灌こ?A0)透過(guò)其完整的細(xì)胞膜嵌入DNA，幾乎全部呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常。沒(méi)有明顯的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變；經(jīng)H202處理的模型組的細(xì)胞發(fā)生了邊緣化、核凝集等發(fā)綠色熒光的早期凋亡現(xiàn)象，并且因?yàn)殇寤义V(EB)透過(guò)其破損的細(xì)胞膜嵌入DNA，呈現(xiàn)出橘黃色熒光的晚期凋亡現(xiàn)象：而經(jīng)過(guò)朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理的PCI2細(xì)胞呈現(xiàn)出早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞皆有減少的現(xiàn)象，并呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴(lài)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了朝鮮薊副產(chǎn)物中脂溶性提取物對(duì)PCI2神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。利用GC-MS對(duì)朝鮮薊副產(chǎn)物中萜類(lèi)及甾醇類(lèi)化合物進(jìn)行定性與定量分析，結(jié)果表明，主要含有3種倍半萜內(nèi)脂，2種甾醇及8種五環(huán)三萜。試驗(yàn)以H202作為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探究朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物的生理活性，發(fā)現(xiàn)該提取物可降低PCI2神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，并且伴隨細(xì)胞內(nèi)LDH漏出率、MDA含量及ROS水平的降低。經(jīng)過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染及A0-EB雙染后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂溶性提取物處理的PCI2細(xì)胞凋亡率顯著降低，與熒光顯微鏡的觀察結(jié)果一致。綜上，朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物對(duì)PCI2神經(jīng)細(xì)胞具有抗凋亡及保護(hù)作用，值得進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用與研究。