海產(chǎn)品口味美味、營養(yǎng)豐富，備受顧客的鐘愛，殊不知，海產(chǎn)品非常容易腐壞霉變，導(dǎo)致很大的財產(chǎn)損失。因為微生物菌種的成長和侵入是造成 海產(chǎn)品腐壞的首要要素，因而海產(chǎn)品的儲藏全過程中對生物的抑止十分關(guān)鍵。超低溫儲藏技術(shù)性是應(yīng)用最開始，也是使用最廣泛的海產(chǎn)品冷藏技術(shù)性。超低溫會使微生物菌種的生理學(xué)功能產(chǎn)生主要的轉(zhuǎn)變，例如膜流通性減少，核苷酸二級結(jié)構(gòu)可靠性提高，基因表達(dá)、漢語翻譯及蛋白質(zhì)伸縮的效果下降等。在較低溫度下有一些微生物菌種仍能以一定的發(fā)育速度生長發(fā)育，即便生長發(fā)育比較慢。腐壞希瓦氏菌是一種耐冷菌，在0℃下也可以生長發(fā)育、繁育，其在有氧運動冷藏或冷凍情況下是多種多樣海產(chǎn)品的特殊腐壞菌，造成冷凍海產(chǎn)品的腐壞霉變，這明顯減少了海產(chǎn)品的質(zhì)量，極有可能造成食品衛(wèi)生安全難題。由于海產(chǎn)品冷藏的關(guān)鍵經(jīng)濟(jì)價值，深入了解腐壞希瓦氏菌超低溫融入的分子結(jié)構(gòu)體制，能夠輔助預(yù)測分析腐壞菌在冷凍食品類中的個人行為，有利于開展更確切的風(fēng)險性預(yù)估和預(yù)防。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌種在超低溫功效下易造成冷應(yīng)激狀態(tài)，轉(zhuǎn)化成一系列的抗超低溫蛋白質(zhì)，稱之為冷激蛋白質(zhì)。病菌冷激蛋白質(zhì)是一類包括核苷酸融合冷休克結(jié)構(gòu)域的高寬比傳統(tǒng)的小分子水蛋白質(zhì)（～7.4ku），能夠做為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA融合，阻攔DNA或RNA在較低溫度下產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而推動轉(zhuǎn)錄和翻譯。除此之外，冷激蛋白質(zhì)還參加病菌的好幾個生理學(xué)生物化學(xué)全過程，如：細(xì)胞質(zhì)的流通性，病菌一切正常發(fā)育與分裂，營養(yǎng)成分威逼，病菌的感病等。冷激蛋白質(zhì)對病菌在低溫時修復(fù)生長發(fā)育和充分發(fā)揮體細(xì)胞各種各樣作用是十分關(guān)鍵的，是分析微生物菌種超低溫融入體制的重要蛋白質(zhì)。殊不知，現(xiàn)階段有關(guān)腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的科學(xué)研究很少有報導(dǎo)。

病菌一般有著好幾個冷激蛋白質(zhì)，且冷激蛋白質(zhì)的功效規(guī)律性十分復(fù)雜，并不是全部冷激蛋白質(zhì)都受超低溫誘發(fā)表述。根據(jù)對NCBＩ數(shù)據(jù)庫查詢中腐壞希瓦氏菌方式菌種的全基因組序列查找，發(fā)覺腐壞希瓦氏菌中存有3個典型性冷激蛋白質(zhì)，現(xiàn)階段并未看到相關(guān)其關(guān)鍵冷激蛋白質(zhì)及有關(guān)作用的科學(xué)研究。文中以海產(chǎn)品的腐壞希瓦氏菌為研究對象，根據(jù)PCR擴增得到海產(chǎn)品腐壞希瓦氏菌的3個冷激蛋白質(zhì)基因序列，在這個基礎(chǔ)上根據(jù)生物信息學(xué)剖析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、構(gòu)造和作用特點等，致力于為冷激蛋白質(zhì)在腐壞希瓦氏菌超低溫融入全過程中的功用科學(xué)研究，及其對海產(chǎn)品中腐壞希瓦氏菌的抑止給予參照。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實驗試劑

腐壞希瓦氏菌為本試驗室自腐壞的冷凍大菱鲆中分離出來所得的，于-80℃儲藏。聚合酶鏈反應(yīng)（Polemerasechainreaction，PCR）引物設(shè)計授權(quán)委托生工生物工程項目（上海市）技術(shù)咨詢有限責(zé)任公司生成

EasyTaqRDNAPolymerase，北京市都是金生物科技有限責(zé)任公司；病菌基因DNA獲取檢測試劑盒、GeneRed核酸染料，天根生化高新科技（北京市）有限責(zé)任公司；Biowest瓊脂糖、LB營養(yǎng)成分瓊脂粉、LB營養(yǎng)成分骨頭湯，青島市高科園海博生物技術(shù)性有限責(zé)任公司。

1.2 儀器設(shè)備與機器設(shè)備

防揮發(fā)梯度方向PCR，英國Eppendrof企業(yè)；凝膠電泳及配套設(shè)施機器設(shè)備，英國Bio-Bad公司；少量冷凍離心機，英國Thermo企業(yè)。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白質(zhì)遺傳基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄組測序

活性本試驗室儲藏的腐壞希瓦氏菌，依照基因DNA獲取檢測試劑盒的操作流程獲取基因DNA，運用病菌16SrRNA遺傳基因通用引物27F和1492R開展PCR擴增，得到腐壞希瓦氏菌的16SrRNA遺傳基因（表1）。選用NCBＩ查找近緣腐壞希瓦氏菌菌種基因信息內(nèi)容（GenBank：CP002457.1），根據(jù)注解冷激蛋白質(zhì)遺傳基因以及上、中下游編碼序列，設(shè)計方案引物設(shè)計（表1），開展冷激蛋白質(zhì)的Csp1589，Csp1376和Csp2252遺傳基因的增加。PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)為94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（詳細(xì)表1），72℃45s，循環(huán)系統(tǒng)30次。PCR物質(zhì)經(jīng)2%的瓊脂糖電泳電泳原理檢驗后送至上海生工轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹的搭建

自NCBＩ數(shù)據(jù)庫查詢得到大腸埃希菌（NC_000913.3）的9個冷激蛋白質(zhì)（CspA～Ｉ），以FASTAfile方式儲存。根據(jù)手機軟件ClustalX對轉(zhuǎn)錄組測序所得的腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)和大腸埃希菌的冷激蛋白質(zhì)開展序列比對，并且用Mega7.0中的臨接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）為其搭建系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹，步幅值（Bootstrapvalues）為1000。

1.5 冷激蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

ExPASy網(wǎng)址中的一個專用工具ProtParam來預(yù)測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的基本上生理學(xué)、生物化學(xué)特點，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction專用工具預(yù)測分析冷激蛋白質(zhì)體細(xì)胞精準(zhǔn)定位，用TMHMMServer2.0預(yù)測分析冷激蛋白質(zhì)跨膜地區(qū)，用SignalＩP5.0線上預(yù)測分析冷激蛋白質(zhì)信號肽，用SMART預(yù)測分析冷激蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生以及其作用，用在線軟件NCBＩConservedDomainSearch開展其碳水化合物保守序列剖析。

1.6 構(gòu)造預(yù)測分析與實體模型品質(zhì)評定

應(yīng)用PSＩPRED預(yù)測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。將腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的氨基酸序列遞交到SWＩSS-MODEL網(wǎng)址開展三級構(gòu)造的預(yù)測分析。將搭建的蛋白質(zhì)三級實體模型用PROCHECK和Ｖerify3D開展品質(zhì)評定。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的構(gòu)造評定服務(wù)項目。

1.7 互作蛋白質(zhì)及配位融合結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

用STRＩNG專用工具明確在活身體與腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)存有相互影響的蛋白質(zhì)。這類相互影響既包含蛋白中間立即的物理學(xué)相互影響，也包含蛋白中間間接性的作用關(guān)聯(lián)性。將從SWＩSS-MODEL獲得的模式文檔鍵入COACH，以預(yù)測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)潛在性的配位融合結(jié)構(gòu)域。