2 結(jié)果與剖析

2.1 冷激蛋白質(zhì)遺傳基因的復(fù)制

根據(jù)16S轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的對(duì)比剖析明確該菌為腐壞希瓦氏菌。以這株海產(chǎn)品腐壞希瓦氏菌的基因DNA為模版，用相對(duì)應(yīng)引物設(shè)計(jì)對(duì)冷激蛋白質(zhì)遺傳基因開(kāi)展PCR擴(kuò)增，隨后用2%的瓊脂糖電泳電泳原理檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增物質(zhì)，結(jié)果如圖所示1所顯示。PCR擴(kuò)增物質(zhì)的尺寸在500bp上下，與預(yù)計(jì)的物質(zhì)尺寸相符合。將PCR物質(zhì)送至上海生工轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序編碼序列用ORFFinder軟件和Blast剖析。應(yīng)用ORFFinder軟件的結(jié)果顯示，復(fù)制的基因片段都是有詳細(xì)的開(kāi)放閱讀框（ORF），3個(gè)冷激蛋白質(zhì)遺傳基因Csp1589，Csp1376和Csp2252的ORF長(zhǎng)短各自為210，210，207bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA，各自編號(hào)69，69，6八個(gè)碳水化合物。Blast結(jié)果顯示，海產(chǎn)品腐壞希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白質(zhì)遺傳基因與腐壞希瓦氏菌方式菌種的3個(gè)冷激蛋白質(zhì)遺傳基因的編碼序列相似度均達(dá)100%，表明冷激蛋白質(zhì)高寬比傳統(tǒng)。

2.2 系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹(shù)的搭建

應(yīng)用MEGA7.0手機(jī)軟件搭建腐壞希瓦氏菌和大腸埃希菌的冷激蛋白質(zhì)的系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹(shù)，結(jié)果如圖2所顯示。海產(chǎn)品腐壞希瓦氏菌的冷激蛋白質(zhì)遺傳基因Csp1589和Csp1376與大腸埃希菌的冷激蛋白質(zhì)遺傳基因CspA聚類算法在同一種群，說(shuō)明他們相互之間的有較高的相關(guān)性和較近的親緣關(guān)系。大腸埃希菌CspA為關(guān)鍵的冷誘發(fā)蛋白質(zhì)，超低溫下很多表述。基本推斷Csp1589和Csp1376在腐壞希瓦氏菌對(duì)超低溫威逼的融入中起主導(dǎo)作用。腐壞希瓦氏菌的冷激蛋白質(zhì)遺傳基因Csp2252與大腸埃希菌的冷激蛋白質(zhì)遺傳基因CspD坐落于同一發(fā)枝，大腸埃希菌CspD在營(yíng)養(yǎng)成分欠缺時(shí)很多表述并能融合單鏈DNA，進(jìn)而抑止性染色體的拷貝，因而腐壞希瓦氏菌的冷激蛋白質(zhì)遺傳基因Csp2252很有可能與細(xì)胞生長(zhǎng)分裂相關(guān)。

2.3 冷激蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性

運(yùn)用ProtParam預(yù)測(cè)分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的基本上生理學(xué)、生物化學(xué)特點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表2。預(yù)測(cè)分析的腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)是由68～69個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量在7.4ku上下的小分子水蛋白質(zhì)，且其帶負(fù)電的碳水化合物的量超過(guò)帶正電碳水化合物的量，即酸性氨基酸的量超過(guò)堿性氨基酸的量，PＩ低于7，表明這種蛋白全是酸堿性蛋白，合乎CSPs的特性。蛋白的總均值吸水性為負(fù)值，表明測(cè)量的蛋白質(zhì)皆為吸水性蛋白質(zhì)。由不穩(wěn)定指數(shù)得知，除Csp2252外，蛋白在離體的穩(wěn)定都不錯(cuò)，在大腸埃希菌身體的藥物半衰期超過(guò)10h。PSORT預(yù)測(cè)分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)皆定坐落于細(xì)胞核。TMHMM預(yù)測(cè)分析數(shù)據(jù)顯示腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)均不會(huì)有α螺旋式跨膜，是是非非跨膜蛋白。SignalＩP預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)不會(huì)有信號(hào)肽，不可以代謝到胞外。推斷腐壞希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白質(zhì)均為非代謝型、非跨膜蛋白，冷激蛋白質(zhì)在腐壞希瓦氏菌細(xì)胞核中生成后不開(kāi)展蛋白質(zhì)裝運(yùn)，只是保存在細(xì)胞基質(zhì)中充分發(fā)揮。

2.4 冷激蛋白質(zhì)的碳水化合物保守序列及結(jié)構(gòu)域剖析

將腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質(zhì)的氨基酸序列遞交至CDservice，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：腐壞希瓦氏菌的冷激蛋白質(zhì)Csp1589、Csp1376和Csp2252都具備DNA融合結(jié)構(gòu)域和RNA融合基序，且同歸屬于類S1總科。類S1總科是一類包括與核糖體蛋白S1的RNA融合結(jié)構(gòu)域類似的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)合輯。這類構(gòu)造最開(kāi)始在S1核糖體蛋白中被發(fā)覺(jué)，現(xiàn)階段已在多種多樣RNA有關(guān)蛋白質(zhì)中被發(fā)覺(jué)

SMART預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示：腐壞希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白質(zhì)都包括冷休克結(jié)構(gòu)域（Coldshockdomain，CSD），冷休克結(jié)構(gòu)域歸屬于類S1總科這一超級(jí)家族，且其從原核生物到高真核生物高寬比傳統(tǒng)，具備RNA分子伴侶作用。包括冷休克結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠參加多種多樣體細(xì)胞生理學(xué)生物化學(xué)全過(guò)程，包含對(duì)較低溫度的融入、營(yíng)養(yǎng)成分威逼、細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育階段等。除此之外，由圖3得知腐壞希瓦氏菌的冷激蛋白質(zhì)Csp1589和Csp1376歸屬于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域大家族CspC，是冷誘發(fā)蛋白質(zhì)，因而推斷Csp1589和Csp1376與病菌對(duì)較低溫度的適應(yīng)能力相關(guān)；而腐壞希瓦氏菌Csp2252不屬于CspC大家族，其很有可能參加其他的體細(xì)胞全過(guò)程，這一結(jié)果與所述系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹(shù)的結(jié)果一致。