苯甲酸(鈉)的測(cè)定有氣相色譜法、紫外分光光度法、高效色相色譜法和滴定法等。

(一)高效液相色譜法

1、測(cè)定原理

試樣加溫除去二氧化碳和乙醇，調(diào)節(jié)pH至近中性，過(guò)濾后進(jìn)高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離后，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性和定量。

2、試劑

①氨水：1+1。

②甲醇：經(jīng)0.5μm濾膜過(guò)濾。

③碳酸氫鈉溶液：20g/L。

④乙酸銨溶液：0.02mol/L。稱(chēng)取1.54g乙酸銨，加水至1000mL溶解，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。

⑤苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1000g苯甲酸，加5mL碳酸氫鈉溶液(20g／L)，加熱溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為儲(chǔ)備溶液，此溶液每毫升含苯甲酸1mg。

⑥苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，該溶液每毫升相當(dāng)于0.10mg的苯甲酸。

3、儀器

高效液相色譜儀(帶紫外檢測(cè)器)。

4、操作方法

(1)試樣處理

①果汁類(lèi)：稱(chēng)取5.00～10.0g試樣，用氨水(1+1)調(diào)pH約7，加水定容至適當(dāng)?shù)捏w積，離心沉淀，上清液經(jīng)0.45/μm濾膜過(guò)濾。

②汽水：稱(chēng)取5．00～10.0g試樣，放入小燒杯中，微溫?cái)嚢璩ザ趸迹冒彼?1+1)調(diào)pH～約7。加水定容至10～20mL，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。

③配制酒類(lèi)：稱(chēng)取10.0g試樣，放入小燒杯中，水浴加熱除去乙醇，用氨水(1+1)調(diào)pH約7，加水定容至適當(dāng)體積，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。

(2)高效液相色譜參考條件

①柱：WG-C₁₈4.6mm×250mm，10μm不銹鋼柱。

②流動(dòng)相：甲醇-乙酸銨溶液(0.02mol／L)(5+95)。

③流速：1mL／min。

④進(jìn)樣量：10μL。

⑤檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)230nm，0.2AUFS。

(3)測(cè)定：根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

5、結(jié)果計(jì)算

式中： X——試樣中苯甲酸含量，g/kg；

m’——進(jìn)樣體積中苯甲酸的質(zhì)量，mg；

V₂——進(jìn)樣體積，mL；

V₁——試樣稀釋液總體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

6、討論

①被測(cè)溶液pH對(duì)測(cè)定和色譜柱使用壽命均有影響，pH＜8或pH＜2時(shí)影響被測(cè)組分的保留時(shí)間，對(duì)儀器有腐蝕作用，以中性為宜。

②測(cè)定苯甲酸、山梨酸也可以用MicroPAKCN 104mm×300mm柱，流動(dòng)相可用甲醇-水。

③苯甲酸回收率為90％～110％，山梨酸回收率為90％～95％。

(二)紫外分光光度法

1、原理

樣品中的苯甲酸在酸性條件下可隨水蒸氣蒸出，與樣品中的非揮發(fā)性組分分開(kāi)，然后用硫酸和重鉻酸鉀溶液處理，使苯甲酸以外的其他有機(jī)物氧化分解，將此氧化后的溶液再次蒸餾，用堿液吸收苯甲酸。純凈的苯甲酸鈉在225nm處有最大吸收，測(cè)定吸光度值并與標(biāo)準(zhǔn)品比較，即可計(jì)算出樣品中苯甲酸的含量。

2、操作方法

(1)樣品處理：稱(chēng)取10.0g均勻的樣品，置于250mL蒸餾瓶中，加1mL磷酸、20g無(wú)水硫酸鈉、70mL水、數(shù)粒玻璃珠，進(jìn)行蒸餾。用預(yù)先加有5mL 0.1m01/L NaOH的50mL容量瓶接收餾出液，約收集到45mL時(shí)停止蒸餾，用少量水洗滌冷凝器，最后稀釋至刻度。吸取蒸餾液25mL置于另一250mL蒸餾瓶中，加入33mL 1mol/L重鉻酸鉀溶液25mL、2mol/L硫酸溶液6.5mL，加熱回流10min，冷卻，再加1mL磷酸、20g無(wú)水硫酸鈉、40mL水、數(shù)粒玻璃珠，按上述方法進(jìn)行第二次蒸餾，收集餾出液并稀釋至刻度。

(2)測(cè)定：取第二次蒸餾液5～20mL，用0．01mol/L NaOH定容至一定體積，以0.01mol/L NaOH為對(duì)照液，于225nm處測(cè)定吸光度值。

用5mL 1mol/L氫氧化鈉代替1mL磷酸進(jìn)行第一次蒸餾，按上述樣品處理方法做空白試驗(yàn)，測(cè)定空白溶液的吸光度。

3、結(jié)果計(jì)算

式中：X——樣品中苯甲酸的含量，g/kg；

m₁——測(cè)定用樣品溶液中苯甲酸的含量，mg；

m₀——測(cè)定用空白溶液中苯甲酸的含量，mg；

V——測(cè)定用第二次蒸餾液的體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，g。

二、山梨酸（鉀）的測(cè)定

山梨酸俗名花楸酸，化學(xué)名稱(chēng)為2，4-己二烯酸。山梨酸及其鉀鹽作為酸性防腐劑，在酸性介質(zhì)中對(duì)霉菌、酵母菌、好氧性細(xì)菌有良好的抑制作用，可使這些微生物酶系統(tǒng)失活。

但對(duì)厭氧的芽孢桿菌、乳酸菌無(wú)效。山梨酸是一種不飽和脂肪酸，在機(jī)體內(nèi)可參與正常的新陳代謝，是目前被認(rèn)為最安全的一類(lèi)食品防腐劑。

山梨酸(鉀)的測(cè)定方法看氣相色譜法、高效液色譜法、比色法等。其中氣相色譜法、高效液相色譜法測(cè)定山梨酸(鉀)，其原理、樣品制備、所用試劑、儀器及操作都與苯甲酸的測(cè)定完全相同，只是將苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備液及標(biāo)準(zhǔn)使用液換為山梨酸(鉀)。具體操作見(jiàn)本節(jié)苯甲酸的測(cè)定。

下面介紹分光光度法。

1、測(cè)定原理

提取稃品中山梨酸及其鹽類(lèi)，經(jīng)硫酸-重鉻酸鉀氧化成丙二醛，再與硫代巴比妥酸形成紅色化合物，其顏色深淺與丙二醛含量成正比，可于530nto處比色定量。

2、試劑

(1)重鉻酸鉀-硫酸溶液：0.1m01/L重鉻酸鉀與0.15mol/L硫酸以1：1混合備用。

(2)硫代巴比妥酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g硫代巴比妥酸于100mL容量瓶中，加20mL水，加10mL 1mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻溶解后再加1mol/L鹽酸1mL，以水定容(臨時(shí)用配制，6h內(nèi)使用)。

(3)山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取250mg山梨酸鉀于250mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容(本溶液山梨酸含量為lmg/mL，使用時(shí)再稀釋為0.1mg/mL)。

3、儀器

分光光度計(jì)；組織搗碎機(jī)；10mL比色管。

4、操作方法

(1)樣品處理：稱(chēng)取100g樣品，加200mL水于組織搗碎機(jī)中搗成勻漿。稱(chēng)取勻漿100g，加水200mL繼續(xù)搗1min，稱(chēng)取10g于250mL容量瓶中定容，搖勻，過(guò)濾備用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：吸取0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液于250mL容量瓶中，用水定容。分別吸取2.0mL于相應(yīng)的10mL比色管中，力Ⅱ2mL重鉻酸鉀一硫酸溶液，于100℃水浴中加熱7min，立即加入2.0mL硫代巴比妥酸，繼續(xù)加熱10min，立刻用冷水冷卻，于530nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

(3)試樣測(cè)定：吸取式樣處理液2mL于10mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制操作，于530nm處測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量。

5、結(jié)果計(jì)算

式中：X₁——山梨酸鉀含量，g/kg；

X₂——山梨酸含量，g/kg；

c——試液中含山梨酸鉀的濃度，mg/mL；

m——稱(chēng)取勻漿相當(dāng)于試樣質(zhì)量，g；

1.34——山梨酸與山梨酸鉀之間的換算系數(shù)；

250——樣品處理液總體積，mL；

2——用于比色時(shí)試樣溶液的體積，mL。

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