5、測(cè)定和計(jì)算

（1）將待測(cè)樣10μL注入色譜儀，根據(jù)其峰高或峰面積設(shè)定有關(guān)最佳參數(shù)如最小峰面積；

（2）注入有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10μL進(jìn)行色譜分析；

（3）以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間定性；

（4）根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各響應(yīng)值(峰高或峰面積)作一響應(yīng)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（5）分別注入待測(cè)樣10μL，進(jìn)行色譜分析；

（6）根據(jù)各待測(cè)樣的響應(yīng)值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的含量。

若高效液相色譜儀配有微處理機(jī)，則不必配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，只要選擇與待側(cè)分析樣品濃度相近的(土10%以內(nèi))標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜儀，仍以保留時(shí)間定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)值由計(jì)算機(jī)計(jì)算出校正因子，再由計(jì)算機(jī)用比例計(jì)算法作定量計(jì)算。

七、有機(jī)酸組分的測(cè)定（氣相色譜法）

1、方法原理

在硫酸的催化下，使有機(jī)酸成為丁酸的衍生物，用氣相色譜法分別定量，可定量的有機(jī)酸有:甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、乳酸、異戊酸、異乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、蘋果酸、酒石酸、反丙烯三羥酸以及檸檬酸等。

2、主要儀器

氣相色譜儀：裝有復(fù)火焰離子檢測(cè)器、程序升溫裝置和自動(dòng)記錄器；柱：填充100g·Kg^-1Silicone DC560，Diasolid L (60目～80目)的φ3mm×2m玻璃柱或不銹鋼柱；電熱板：功率50 W；試樣前處理用柱：φ10mm×70mm玻璃柱2根；具塞試管：φ25mm×100mm。旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器；滑線變壓器；玻瑞器皿：20 mL容量瓶，滴定管，安全移液管，冷凝管。

3、試劑

（1）離子交換樹脂:使用Amberlite (一種人工合成的酚甲醛離子交換樹脂)CG120、Amberlite CG4B(或Amberlite IRA410)；

（2）將上述有機(jī)酸分別配成已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，分析時(shí)需要的酸的最小含量，因酸的種類不同而異:甲酸、乙酸等低分子酸為1mg左右；蘋果酸、檸檬酸等為幾毫克；酒石酸如少于10mg便不能獲得高精度的分析結(jié)果；

（3）乙醇溶液〔ψCH₃CH₂OH)=80%]:800mL無(wú)水乙醇(CH₃CH₂OH，分析純)用水稀釋至1L；

（4）氫氧化鈉溶液〔c(NaOH)=0.1mol·L^-1]: 4g氫氧化鈉(NaOH，分析純)溶于水稀釋至1L；

4、操作步驟

（1）試樣準(zhǔn)備

蔬菜:把試樣切成3mm見(jiàn)方，稱取25.0g加溫水(80^oC，部分蔬菜可用80%乙醇代替，研磨，提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=0.1 mol·L^-1〕滴定，使有機(jī)酸成為鈉鹽。中和后的溶液，在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至約15mL,濃縮液移入25mL容量瓶并定容。必要時(shí)可過(guò)濾除去不溶物。

吸取此提取液10mL，用AmberliteCG120,Amberlite CG4B處理，得到有機(jī)酸組分，將其醋化，供氣相色譜分析用。

水果:從新鮮水果試樣中稱取20.0g，加3倍量的80%乙醇研磨，經(jīng)離心分離后，收集上清液，殘?jiān)俜磸?fù)提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=0.1 mol·L^-1〕中和。中和后在80℃恒溫水槽中加熱10min后，定容至200 mL，使用前保存于冰箱中。

取此提取液10mL～50mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無(wú)醇后，依次通過(guò)AmberiteCG120,CG4B及CG120柱，得到有機(jī)酸組分，加入酚酞指示劑并用氫氧化鈉溶液滴定，然后保存于約40℃下，用旋轉(zhuǎn)熱發(fā)器濃縮，干涸后進(jìn)行丁酯化處理。

（2）酯化：用上述方法制備的有機(jī)酸中，加丁醇2mL，無(wú)水硫酸鈉2g，濃硫酸0. 2 mL，連接冷凝管，在電熱板上平穩(wěn)沸騰約30min(加熱時(shí)要不斷攪拌)，使有機(jī)酸成為丁酯。

（3）酯的提取：酯化終了，加水和己烷各5mL，充分混合，使酯轉(zhuǎn)溶于己烷中，每次用己烷5mL提取3次。用移液管移入20 mL容量瓶中，容量瓶中事先巳裝有5g·L^-1十九烷(內(nèi)標(biāo))的己烷溶液1 mL，用己烷定容。再加無(wú)水碳酸鈉0.5g，去除混入的微量硫酸。取5μL進(jìn)行氣相色譜分析。

（4）分析：柱子在60℃下保持6 min后，以每分鐘升溫5℃的速度升至250^oC。氮?dú)?、氫氣、空氣的流量分別為60 mL/min、50 mL/min、900 mL/min,注入口及檢測(cè)器的溫度為260℃。靈敏度為10mL，范圍為0.01V。

（5）工作曲線的制備：將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸用上述方法制成丁酯后，用氣相色譜儀分析，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5、注意事項(xiàng)

（1）蔬菜中的有機(jī)酸，50%～90%以結(jié)合酸的形式存在，用80%乙醇提取比用溫水的提取率低。

（2）其中所含總有機(jī)酸換算成檸檬酸要在100mg以下。分析蔬菜時(shí)以吸取10mL～20mL為宜。

（3）薯類若用溫水提取試樣，用離子交換樹脂處理時(shí)則需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以這里用80%乙醇提取，溜去乙醇后，再進(jìn)行離子交換樹脂處理。

（4）大部分蔬菜試樣有時(shí)混入一些丁醇不溶物或酯化反應(yīng)液呈淺褐色，但對(duì)測(cè)定值沒(méi)有影響。

（5）對(duì)于含結(jié)合酸多的水果，用溫水提取的提取率高。但果膠等混入，粘度將增大，往往會(huì)使以后的處理費(fèi)事，故乙醇的濃度應(yīng)選擇適當(dāng)。

（6）其中所含的總有機(jī)酸換算成檸檬酸要在100mg以下，水果以相當(dāng)于新鮮物重1 g～10g的試樣為宜。

（7）濃縮使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器即可，如能進(jìn)行冷凍干燥則更好。

（8）使用油浴也可，使用電熱板從試管底部加熱方便。沸騰劇烈時(shí)用滑線變壓器調(diào)節(jié)。

參考資料：土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法