為實現(xiàn)梔子油中重要活性物質(zhì)藏紅花酸的準確定量，選取超聲輔助液液萃取和固相萃取2種前處理方法進行系統(tǒng)探討，重點考察了溶油試劑、料液比、萃取試劑種類、萃取試劑濃度、液液萃取時間、液液萃取溫度以及液液萃取次數(shù)等因素。

在2種前處理方法的最優(yōu)條件下，超聲輔助液液萃取獲得的藏紅花酸含量高于固相萃取，且超聲輔助液液萃取操作簡單、耗時短、能耗低。因此，最優(yōu)前處理條件確定為：超聲輔助液液萃取，以N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶油試劑，料液比為0.5 g油：5 mL DMF，100%甲醇為萃取試劑，室溫超聲2 min，萃取1次，檢測到的梔子油中藏紅花酸含量的平均值為69.65 μg/g（RSD=4.45%）。

在此基礎(chǔ)上，對菜籽油進行加標回收實驗，平均加標回收率為86.61%（RSD=1.16%），體現(xiàn)了方法的可行性和穩(wěn)定性。該實驗建立的方法可用于梔子油中藏紅花酸的HPLC快速、準確定量檢測。

藏紅花酸化學(xué)式為C20H24O4，屬于類胡蘿卜素。藏紅花酸是珍貴的藥用資源，在預(yù)防心血管疾病方面具有一定功效，通過增強脂質(zhì)和膽固醇的排泄，防治高血脂和動脈粥樣硬化。此外，藏紅花酸還具有預(yù)防阿爾茨海默病、減少皮膚損傷、抗抑郁、保護肝臟、抗腫瘤等作用。

目前，大多將藏紅花作為獲取藏紅花酸的來源，而藏紅花價格昂貴，是意大利、土耳其、伊朗等地栽培的一種草本植物。梔子具有多種生物活性，是除藏紅花以外，唯一含有藏紅花酸的植物。藏紅花在我國少有種植，而梔子相對便宜、適應(yīng)性強、種植成活率高，是原產(chǎn)于我國的重要木本植物資源之一。

藏紅花酸含量是梔子質(zhì)量的重要評價指標之一。目前，關(guān)于梔子中藏紅花酸含量的檢測方法已有一些報道，如：張永利等采用酶解法將梔子果中的藏紅花素轉(zhuǎn)化為藏紅花酸，并用紫外分光光度法進行檢測。陳雁等采用HPLC法檢測梔子果中的藏紅花酸和藏紅花素。梔子果具有20%～25%的可食用脂肪，可加工成梔子油，類似山茶油和橄欖油等產(chǎn)品，屬于國家支持、倡導(dǎo)的大健康新型木本植物油。

CAI X等通過HPLC-DAD/ESI-MS發(fā)現(xiàn)梔子油中含有藏紅花酸。食用油中的微量活性營養(yǎng)物質(zhì)是評價食用油品質(zhì)的重要指標。而藏紅花酸作為一種梔子油特有的功能性成分，也許可以作為評價梔子油營養(yǎng)品質(zhì)的重要參考指標。GB 509.149—2016《食品安全國家標準 食品中梔子黃的測定》中涉及到液體中藏紅花酸的分析方法，將醬油等液體用甲醇溶解后直接進樣檢測，但該法并不適用于植物油。

由于植物油不能溶解在甲醇中，所以油料需先經(jīng)過溶油試劑處理，再用有機溶劑萃取其中的藏紅花酸。因此，如何有效溶油并高效提取、檢測其中的藏紅花酸是方法的重點所在，現(xiàn)階段，植物油中藏紅花酸的定量檢測方法未見報道。

超聲輔助液液萃取法是一種傳統(tǒng)的樣品分離技術(shù)。該方法無需多余儀器，耗時短、效率高，但對于樣品的分離純化可能不夠完全。如：劉金銘等采用超聲輔助液液萃取提取食品中的活性成分。

固相萃取法對于樣品的凈化效果更好，可以降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度，但固相萃取SPE小柱價格較高。如：陳坤等采用C18固相萃取柱對食用油凈化，檢測其中的乙基麥芽酚。

文章系統(tǒng)比較了2種前處理技術(shù)，篩選得到了梔子油中藏紅花酸的最優(yōu)提取方法，建立了梔子油中藏紅花酸的HPLC快速、準確定量檢測方法，為梔子中藏紅花酸的研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，對梔子健康功能油的開發(fā)及品質(zhì)評價提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

藏紅花酸標準品（純度≥98%）；Methyl Alcohol（HPLC級）、Acetonitrile（HPLC級）；乙醇、甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、石油醚、氯仿；正己烷、吡啶；CNWBOND Diol二醇基固相萃取SPE小柱；梔子油：浙江驕梔科技有限公司；原香菜籽油：金太陽糧油股份有限公司。

BAS224S分析天平，DS-2510DTH超聲波清洗器，D-37520超速離心機，SHB-Ⅲ-A循環(huán)水式多用真空泵，Essentia LC-16島津高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準樣品儲備液的制備

藏紅花酸標準品儲備液的制備：準確稱取0.60 mg（精確至0.1 mg）藏紅花酸標準品，用吡啶溶解完全后，加入甲醇（色譜級）并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，混勻，定容，獲得12 μg/mL的藏紅花酸標準儲備液。

1.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱為反相柱子Kinetex 5u XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex）。色譜條件參照GB 509.149—2016《食品安全國家標準 食品中梔子黃的測定》：流動相為乙酸-乙酸銨緩沖溶液（A）-乙腈（B）；洗脫梯度：0.0～1.0 min，20%B；1.10～8.0 min，20%～60%B；8.0～8.1 min，60%～70%B；8.10～13.0 min，70%～98%B；13.10～15.0 min，98%～20%B；15.10～20.0 min，20% B；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。

1.2.3 超聲輔助液液萃取

1.2.3.1 溶油試劑種類及料液比

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，分別加入5 mL正己烷、DMF、石油醚、氯仿溶油。待油液全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，常溫條件，立即超聲2 min。超聲后，經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機相，用甲醇定容到25 mL容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進行液相分析。選擇好溶油試劑之后，再對料液比進行優(yōu)化：即分別加入2.5、5、7.5、10、12.5 mL DMF。

1.2.3.2 萃取試劑種類及濃度

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油液全部溶解后，分別加入10 mL濃度100%的乙酸、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機相，甲醇定容到25 mL的容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進行液相分析。選擇好萃取試劑之后，再對萃取試劑濃度進行優(yōu)化：即分別加入濃度70%、80%、90%、100%的甲醇。

1.2.3.3 溫度及時間對提取梔子油中藏紅花酸的影響

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油液全部溶解后，加入10 mL濃度100%的甲醇，保持時間2 min不變，分別在30、60、90 ℃條件下進行前處理，然后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機相，甲醇定容到25 mL的容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進行液相分析。時間條件為：30 ℃時，分別在2、12、22、32 min條件下進行前處理。

1.2.3.4 萃取次數(shù)

確定溶油試劑、料液比、萃取試劑種類及濃度、超聲溫度和時間等因素后，對萃取次數(shù)進行優(yōu)化：稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機相，甲醇定容到50 mL的容量瓶中，獲得萃取1次的樣品；稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機相到50 mL容量瓶中。

再次往離心后的油相中加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取第二次的有機相到放置于第一次有機相的50 mL的容量瓶中，并用甲醇定容。此為提取2次的樣品。同理可得，提取3次的樣品。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進行液相分析。

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