（4）pH的選擇

為了驗(yàn)證溶液pH對(duì)氨基酸檢測(cè)含量的影響，移取相同量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，調(diào)節(jié)溶液酸堿性配成不同pH(2.0～13.0)的同一理論濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸5種組分幾乎不受pH的影響，在酸性和堿性條件下，測(cè)定含量均比較穩(wěn)定；而谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸這6種組分檢測(cè)含量受溶液pH的影響較大。

從圖3中可以看出，谷氨酸、絲氨酸受pH影響最大，兩種組分在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性條件下測(cè)定含量均出現(xiàn)了大幅增大，說明在酸堿性條件下這兩種氨基酸在溶液中離子含量較中性時(shí)出現(xiàn)明顯增大，這與其自身的分子結(jié)構(gòu)、特性及解離常數(shù)有直接聯(lián)系；苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸4種組分測(cè)定含量在酸性和堿性條件下波動(dòng)較大，當(dāng)pH小于4.0時(shí)，測(cè)定含量是中性條件下測(cè)定含量的86％～128％，而當(dāng)pH大于10.0時(shí)，這4種組分測(cè)定含量波動(dòng)范圍是98％～127％。這些組分受pH的影響較大，主要是因?yàn)榘被崾莾尚噪娊赓|(zhì)，在酸性條件下，氨基(-NH2)吸收H+帶正電，在堿性條件下，羧基(-COOH)可以失去H+帶負(fù)電，因此在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液中氨基酸離子含量不穩(wěn)定，測(cè)定含量也就隨之波動(dòng)。氨基酸所帶的正負(fù)電荷數(shù)量相等時(shí)，即靜電荷為零的兩性離子狀態(tài)下的pH稱為氨基酸的等電點(diǎn)。而所測(cè)17種氨基酸的等電點(diǎn)在5.05～9.60之間，此時(shí)溶液中氨基酸離子含量穩(wěn)定，綜合考慮20種組分物化特性、等電點(diǎn)、解離常數(shù)等相關(guān)影響因素，我們選擇pH在5.5～7.0條件下，進(jìn)行定量分析。

2、方法學(xué)考察

（1）線性范圍與檢出限

配置20種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并進(jìn)行校準(zhǔn)曲線擬合。通過色譜峰信噪比來(lái)計(jì)算待測(cè)組分的檢出限(S／N=3)，在0.05mg／L～2.50mg／L濃度范圍內(nèi)，進(jìn)行了6個(gè)不同濃度水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.50mg／L)標(biāo)準(zhǔn)工作液的檢測(cè)和線性擬合。結(jié)果(見表2)表明，20種組分線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995，其中有15種組分相關(guān)系數(shù)大于0.999，說明在該實(shí)驗(yàn)條件下，20種組分同時(shí)檢測(cè)時(shí)線性相關(guān)性良好。20種組分檢出限在0.00107～0.06427mg／L之間，除了個(gè)別亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸外，其他17種檢出限均小于0.05mg／L。

（2）回收率與精密度

分別選取葡萄、橙汁、芒果汁3種果汁飲料樣品，依次向3個(gè)樣品中添加濃度級(jí)別水平分別為0.20mg／L、0.50mg／L、2.00mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證不同果汁基質(zhì)測(cè)定時(shí)方法的回收率和精密度，根據(jù)基質(zhì)濃度、添加濃度和添加后測(cè)定濃度計(jì)算回收率。表3列出三濃度水平、六次平行測(cè)定回收率和RSD數(shù)據(jù)。
 

從表3中可以看出，在0.20mg／L和0.50mg／L添加濃度水平下，精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的回收率相對(duì)較低，回收率多數(shù)在82％～90％之間，但依然滿足食品理化檢驗(yàn)技術(shù)要求(測(cè)定含量小于O.10mg／L，回收率應(yīng)在60％～120％)。20種組分三濃度水平添加回收率在82.73％～107.39％之間，RSD在1.97％～8.72％范圍內(nèi)，這說明20種氨基酸測(cè)定回收率好。從總體上來(lái)看，三種基質(zhì)、六次平行測(cè)定回收率數(shù)據(jù)結(jié)果符合食品理化檢測(cè)要求，表明方法準(zhǔn)確性高、精密度好。

3、實(shí)際樣品分析

隨機(jī)抽取5種常見果汁飲料(橙汁、芒果汁、蘋果汁、葡萄汁、椰子汁)，按照離子色譜儀：ICS5000+；色譜柱：AminoPacPAl0(2×250mm)，保護(hù)柱：AminoPacPAl0(2×50mm)；積分安培檢測(cè)；工作電極：Gold(au)-AAA；參比電極：pH電極；電位波形：G10d，pH-Ag-AgClRE，舭A；流動(dòng)相：A-NaOH溶液，B-去離子水，C-醋酸鈉溶液；流速：0.25mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：25μL中離子色譜條件和準(zhǔn)確取果汁待檢樣品0.100g，加入去離子水約150min，搖勻、靜置15min，調(diào)節(jié)稀釋液pH至5.5～7.0，全部轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶中，采用去離子水定容至刻度，搖勻、靜置15min，取10.0mL溶液，先過0.229m水相濾膜，再過已預(yù)活化的RP柱，棄去前3mL，收集清液，待上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行了實(shí)際樣品中氨基酸含量的檢測(cè)分析，圖4是實(shí)際樣品測(cè)定離子色譜圖。

從5種果汁色譜圖對(duì)比來(lái)看，橙汁和葡萄汁中氨基酸的種類最多，共檢出15種氨基酸，其次是蘋果汁，檢出14種氨基酸，而芒果汁、椰子汁中檢出氨基酸僅有7種和6種；從氨基酸含量來(lái)看，檢出含量較大的依次是丙氨酸、甘氨酸、精氨酸，這三種氨基酸也是果汁中主要的氨基酸。因此，建議在日常生活中多飲用橙汁、葡萄汁、蘋果汁，以確保身體攝取足量的氨基酸。

三、結(jié)論

本文采用多級(jí)梯度淋洗(MGE)和積分脈沖安培檢測(cè)(IPAD)相結(jié)合的方法，通過對(duì)流速、柱溫、溶液pH、初始梯度濃度等多種實(shí)驗(yàn)影響因素的分析討論，探索出適合20種氨基酸分離的梯度淋洗條件，建立了梯度淋洗-積分安培檢測(cè)-離子色譜同時(shí)測(cè)定果汁中20種氨基酸的分析方法。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，流速為0.25mL／min，柱溫為30℃時(shí)，pH在5.5～7.0之間，20種組分的測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。檢測(cè)方法高效快捷、靈敏準(zhǔn)確、綠色環(huán)保，可以為果汁質(zhì)量控制和營(yíng)養(yǎng)學(xué)判定，提供一種快速定性定量方法。

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