一、分析意義

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，在育種、食品和飼料等工作中常常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。全氨基酸和個(gè)別氨基酸的分析測(cè)定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。生物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)的許多領(lǐng)域都需要分析氨基酸。在評(píng)價(jià)谷物的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值時(shí)需要測(cè)定游離氨基酸及蛋白質(zhì)的氨基酸組成。動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為兩種，即構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸，另外，還有少量的由肽鍵連接的幾個(gè)氨基酸，以及與糖或脂結(jié)合在一起的。在人類和動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)上，各種氨基酸含量的高低是很重要的，特別是有幾個(gè)限制性氨基酸，如稱為“第一、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是一種必需氨基酸，即必須從食物中直接吸收，而不能由人與動(dòng)物利用食物中的其它成分自身合成，卻又對(duì)人與動(dòng)物的生長發(fā)育起著重要作用的氨基酸;若缺乏這些氨基酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些疾病，而這些氨基酸在貯存和加工的過程中極易損失破壞，因此它們的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。

二、蛋白質(zhì)的測(cè)定

（一）方法選擇的依據(jù)

蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類，一是利用蛋白質(zhì)中含有一定量的氮，通過測(cè)定樣品中的含氮量再乘以換算系數(shù)，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量，如開氏法;另一類是依據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，如染料結(jié)合法雙縮脲法和螢光法等。最常用的方法是開氏法，但開氏法測(cè)定的氮中還包含有氨基酸、酸氨等非蛋白質(zhì)氮，由此而計(jì)算出的蛋白質(zhì)，故稱“粗蛋白質(zhì)”，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。

開氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，這個(gè)方法是丹麥人開道爾于1883年用來研究蛋白質(zhì)變化的，后來被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。由于設(shè)備簡單易得，結(jié)果可靠，為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。至今尚沒有別的方法能與其比擬或?qū)⑵淙〈?。因此國際谷物化學(xué)協(xié)會(huì)和美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)以及我國等一些國家都把開氏法作為標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。但開氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用較高。近年，已出現(xiàn)幾種以開氏法原理為基礎(chǔ)的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開氏定氮儀，如瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開氏1030分析儀(Kjeltec Auto 1030 Analyzer);日本生產(chǎn)的Kjel-Auto自動(dòng)氮和蛋白質(zhì)分析僅和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel-FOSS自動(dòng)蛋白質(zhì)分析儀等，這些儀器雖然自動(dòng)化程度較高，但價(jià)錢昂貴，目前尚不能普及。

在生產(chǎn)和科研工作中，為了完成大批樣品的分析，需要采用快速、簡易的分析方法，例如染料結(jié)合法、雙縮脲法、水合茚三酮法、亮磺化黃素螢光法、紅外光譜法，核磁共振法、以及測(cè)定開氏消煮液中按的靛酚藍(lán)法和納氏比色法。根據(jù)一般實(shí)驗(yàn)室的條件，這里側(cè)重介紹開氏法和染料結(jié)合法。

（二）籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定（開氏法）

1、方法原理

氮是蛋白質(zhì)中的主要成分，同類植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量基本上是固定不變的。因此，可用開氏法消煮定氮，再將測(cè)得的含氮值乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得粗蛋白質(zhì)含量。氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16%為根據(jù)導(dǎo)出的值，但不同植物籽位中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的因數(shù)也稍有不同。以定量蛋白質(zhì)為目的的總氮量測(cè)定中，開氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，須要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開氏法測(cè)定總氮量，同時(shí)用離子電極法測(cè)定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。

2、儀器及設(shè)備

消煮爐或電爐，消煮管100mL或50 mL，半微量定氮裝置，半微量滴定管。

3、試劑

（1）硫酸(H₂SO₄，p≈1.84 g·cm^-3，化學(xué)純);

（2）高錳酸鉀溶液［(KMnO₄)=50g·L^-1]:5g高錳酸鉀(KMn0₄，化學(xué)純)溶于水稀釋至100 mL;

（3）還原鐵粉(Fe，分析純);過100目篩;

（4）混合催化劑:硫酸鉀(K₂SO₄，化學(xué)純)、硫酸銅(CuSO₄·5H₂0，化學(xué)純)與硒粉(Se，化學(xué)純)100:10:1混合磨細(xì);

（5）氫氧化鈉溶液〔c(NaOH)=10mol·L^-1]:400g氫氧化鈉(NaOH，化學(xué)純)溶于水，冷卻后稀釋至1L;

（6）硼酸溶液[p(H₃B0₃)=20g·L^-1]:20g硼酸(H₃80₃，化學(xué)純)溶于水，稀釋至1 L;

（7）混合指示劑:0.1g甲基紅0.5g溴甲酚綠溶于100 mL乙醇[ψ(CH₃CH₂OH)=95 %]中;

（8）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(HC1=0.01mol·L^-1]:吸取濃HCI 8.3mL注入1L水中先配成(HC1)=0.1 mol·L^-1鹽酸溶液，用標(biāo)準(zhǔn)Na₂CO₃標(biāo)定后(GB601-88),準(zhǔn)確稀釋10倍。

4、操作步驟

（1）樣品的消煮：稱取烘干樣品(過0.25mm篩子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL開氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5 mL濃H₂S0₄，小心輕搖后(最好加塞放置過夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐或電爐上，開始時(shí)用小火加熱，當(dāng)消煮液呈棕色時(shí)，提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍(lán)色時(shí)，再加熱約10min，取下，冷卻至溫?zé)釙r(shí)，將消煮液無損地轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后，定容并放置澄清。

（2）氮的測(cè)定：用移液管吸取澄清待測(cè)液5.00 mL或10.00 mL放人半微量定氮儀中進(jìn)行定氮(以下操作同土壤全氮的測(cè)定)。同時(shí)作空白試驗(yàn)，校正試劑和滴定誤差，并做核對(duì)試驗(yàn)。

5、結(jié)果計(jì)算

粗蛋白質(zhì)%(干基)=(V-Vo) ×c×14×10^-3×分取倍數(shù)×k ×100÷m

式中:V——樣品測(cè)定所消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;

Vo——空白試驗(yàn)所有耗去鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;

10^-3——將mL換算成L的系數(shù)；

C——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mot·L;

14——氮的摩爾質(zhì)量，g·mol^-1;

10^-3——針mL換算成L的系數(shù);

分取倍數(shù)——100/5或100/10;

M——樣品質(zhì)量，g，干基；

k——氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)。

參考資料：土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法