火龍果屬仙人掌科三角柱屬，原產于墨西哥、中美洲和南美洲，因其健康特性和營養(yǎng)價值受到重視而被廣泛種植。目前，市面上常見的火龍果品種主要有：白肉火龍果、紅肉火龍果和紫紅肉火龍果3種。其中，紅肉火龍果果肉中富含白肉火龍果所缺少的甜菜色素，還含有豐富的不飽和脂肪酸、水溶性食物纖維等。除了有較高的營養(yǎng)價值外，紅肉火龍果在抗氧化方面對人體也有一定的輔助作用。

果實中有機酸的組成與含量是影響果實風味品質的重要因素。果實中存在許多種類的有機酸，然而大多數(shù)果實通常以1種有機酸為主，少數(shù)以多種為主。根據(jù)主要有機酸的種類，可以將果實分為蘋果酸型果實、檸檬酸型果實和酒石酸型果實等。果實中的有機酸代謝是一個復雜的生理過程，由有機酸的合成和降解共同決定。有研究表明，蘋果酸是火龍果的主要有機酸。蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和蘋果酸酶(NADP-ME)是蘋果酸代謝中關鍵的3個酶，前兩者催化蘋果酸的合成，后者則參與蘋果酸的降解，它們共同調節(jié)了火龍果生長發(fā)育過程中蘋果酸的代謝和積累，其含量是一個動態(tài)變化的過程，可影響火龍果的風味品質。

目前關于紅肉火龍果中蘋果酸的代謝變化還未見研究報道。本試驗研究了“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果貯藏過程中的品質變化和蘋果酸代謝關鍵基因NADP-ME、PEPC和NAD-MDH的表達差異，為進一步研究紅肉火龍果采后貯藏過程中蘋果酸積累的調控機制和對風味特性形成的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

“玫瑰香”品種火龍果，采自浙江省江山市秋實家庭農場；“大紅一號”品種火龍果，采自浙江省諸暨市雪鋒火龍果基地，保鮮車運回實驗室后置于10℃冷庫中預冷12h。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸、福林-酚等(分析純級)，購自國藥集團化學試劑有限公司；色譜級甲醇、色譜級乙腈，購自美國迪馬科技公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸及琥珀酸標準品，購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；異硫氰酸苯酯、三乙胺、游離氨基酸混標，購于美國Sigma試劑公司：PEPC測定試劑盒。購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

TAXTPlus型質構儀，英國SMS公司：PAL-1型手持折射儀，日本ATAG0公司；877Titrinoplus自動電位滴定儀，瑞士萬通股份有限公司；UV-9000紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司：Waters高效液相色譜儀(型號e2695-2998配有PDA檢測器)，沃特世科技(上海)有限公司；微量分光光度計，日本SHIMADZY公司；恒溫擴增PCR儀，美國賽默飛世爾科技公司：微量核算蛋白測定儀，美國賽默飛世爾科技公司：The瑚oMR23i高速低溫冷凍離心機。法國捷安特集團股份有限公司。

1.3 試驗方法

挑選無機械損傷，果實大小和成熟度相對一致的“玫瑰香”火龍果和“大紅一號”火龍果。用2％次氯酸鈉浸泡消毒后自然晾干，于25℃恒溫培養(yǎng)，每組3次重復。分別在貯藏第0，1，2，3，4，5，6。7，8天定期取樣，置于液氮中迅速凍存，混合后分裝至樣品袋中，于-80℃保存。用于后續(xù)品質指標測定。

1.3.1 硬度的測定

參考黃子娟的方法。并稍作修改。采用質構儀測定火龍果的果皮硬度和果肉硬度，使用直徑2mm探頭(P/2型)，選取火龍果果實無鱗片的赤道部位進行穿刺測定，重復3次，取平均值，單位為N。

1.3.2 可滴定酸含量的測定

采用可滴定酸自動電位滴定儀測定。果肉勻漿后過濾，取濾液1mL，用去離子水定容至100mL。以0.05mol/LNa0H溶液滴定，記錄滴定終點時所用堿溶液的體積，并計算可滴定酸含量，重復3次。

1.3.3 可溶性固形物含量的測

采用手持折射儀測定樣品可溶性固形物含量，重復3次。

1.3.4 維生素C含量的測定

參考吳媛媛等的方法。稱取1g火龍果研磨樣，加入5％TCA溶液，混勻后離心。取上清液依次加入5％三氯乙酸、0.5％鄰菲羅琳-乙醇溶液、0.5％磷酸-乙醇溶液、0.03％三氯化鐵-乙醇溶液和1mL無水乙醇后于30℃水浴1h。用蒸餾水調零，以蒸餾水代替上清液為參比。在波長534nm處測定吸光度值，重復3次，單位為mg/100g。

1.3.5 總酚含量的測定

采用福林酚比色法，參考范智義等的方法，并作適當修改。稱取火龍果研磨樣1.0g，加入5.OmL60％乙醇浸提2h，10000×g離心15min，取上清液1mL至25mL具塞試管中，加入3mL1.0mol/L福林酚試劑后搖勻，靜置5min后加入6mL7.5％碳酸鈉，用蒸餾水定容至25mL。室溫下在暗處放置2h，以不加沒食子酸的樣品為空白，于波長760nm處測定其吸光度值，重復3次，以沒食子酸含量為標準物測定總酚含量，單位為μg/g。

1.3.6 可溶性糖含量的測定

參考曹健康等的苯酚一硫酸法，并作適當修改。稱取火龍果研磨樣1.0g，加入5。10mL蒸餾水后封口，于100℃水浴30min。冷卻后過濾。濾液移入100mL容量瓶，回收殘渣，加入5～10mL蒸餾水于100℃水浴10min后冷卻、過濾，合并濾液。取500μL樣品液于試管中。加入1.5mL蒸餾水和1.0mL9％苯酚，搖勻，在5～20s內加入5mL濃硫酸，搖勻，室溫下反應30min，以空白為參比，在波長485nm處測定其吸光度值，重復3次。

1.3.7 有機酸組分的測定

1) 色譜條件

C18反相色譜柱(3.9mm×300mm，5μm)；柱溫30℃；流動相為0.04mg/LKH2PO4-H3P04緩沖溶液：甲醇=95:5(體積比)；流速0.8mL/min；進樣體積10μL；配有PDA檢測器，檢測波長214nm；外標法定量。

2) 提取方法

用高效液相色譜法，參考關秀杰等的方法，并作適當修改。稱取火龍果研磨樣5.0g于10mL容量瓶，加入一定量流動相，于75℃水浴45min，冷卻至室溫，定容。渦旋2min，超聲提取15min，過濾分離蛋白質等大分子物質。取一定量濾液，離心10min后用0.45μm孔徑的濾膜過濾上清液，備用。

1.3.8 NAD-MDH和NADP-ME酶活的測定

1)酶液提取

參考Masashi等和Hirai等的方法，稍作修改。取5g火龍果研磨樣，加入10mL經預冷的研磨緩沖液(包含10mmol/L異抗壞血酸、0.6mol/L蔗糖、0.2mol，LTris-HCl，pH8.2)，低溫離心后取上清液。用pH8.2的提取緩沖液(包含10mm01/L異抗壞血酸、0.1％曲拉通X-100、0.2mol/LTris-HCl)定容到50mL，混勻后用提取緩沖液定容至100mL，酶液低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2)酶活測定

NAD-MDH和NADP-ME酶活性測定參考Hirai等的方法。

1.3.9 PEPC酶活的測定

使用PEPC測定試劑盒測定樣品中PEPC的酶活。

1.3.10 總RNA提取及檢測

使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取火龍果總RNA。取1μLRNA通過核酸蛋白測定儀測定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值檢驗RNA純度，用普通瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。

1.3.11 RT-qPCR分析

以總RNA為模版，采用諾維贊反轉錄試劑盒，在冰浴條件下進行第1鏈cDNA的合成。

蘋果酸代謝相關基因引物(表1)通過Primer軟件自主設計，檢驗引物熔解曲線單一(無特異性產物)后，可用于實時熒光定量分析。

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