2.2 廉價(jià)碳源的利用

實(shí)現(xiàn)低成本PHAs生產(chǎn)，尋找經(jīng)濟(jì)可行且穩(wěn)定高效合成PHAs的發(fā)酵物料是關(guān)鍵，尤其是占發(fā)酵物料總成本70%–80%的碳源替代物。合理利用廉價(jià)碳源，尤其是工農(nóng)業(yè)廢棄物料，能夠有效降低PHAs的生產(chǎn)成本，增加PHAs的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

2.2.1 農(nóng)業(yè)廉價(jià)碳源

作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，我國(guó)廉價(jià)碳源儲(chǔ)量豐富。玉米淀粉經(jīng)液化、糖化、滅酶處理后用于發(fā)酵生產(chǎn)增加了使用成本，因此開發(fā)直接利用玉米淀粉的PHAs生產(chǎn)菌株十分重要。Shamala等篩選出一株能同時(shí)實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶分泌和PHAs積累的芽孢桿菌Bacillus sp.CFR-67。相比于30 g/L的葡萄糖，當(dāng)以30 g/L玉米淀粉作為碳源時(shí)，CFR-67的生物量和PHAs分別提高了25%和50%。如果同時(shí)添加5 g/L的麥麩和米糠水解液，CFR-67的生物量達(dá)到10 g/L，PHAs含量升高至5.9 g/L。地中海富鹽菌Haloferax mediterranei ATCC 33500利用膨化玉米淀粉和膨化米糠作為復(fù)合碳源時(shí)生物量達(dá)到140 g/L，PHAs產(chǎn)量達(dá)到77.8 g/L。由此可見，直接利用玉米淀粉可以實(shí)現(xiàn)高生物量和高PHAs的積累。近年來(lái)也有研究人員嘗試將米糠、麥麩等農(nóng)業(yè)廢棄物用作PHAs的發(fā)酵碳源。米糠含有19.9%(W/W)的淀粉和19.5%(W/W)的脂肪，經(jīng)水解后可以被重組大腸桿菌E.coli XL1-Blue和真氧產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha NCIMB11599用作合成PHB的碳源。

秸稈經(jīng)生物煉制得到的纖維素和木質(zhì)素同樣可以作為PHAs生產(chǎn)的碳源。Li按照葡萄糖︰木糖︰阿拉伯糖=4︰2︰1的比例模擬纖維素水解液驗(yàn)證其用于PHAs生產(chǎn)的可能性。結(jié)果顯示，伯克霍爾德氏菌Burkholderia sacchari DSM 17165的PHAs產(chǎn)量占生物量的77%，達(dá)到67 g/L。木質(zhì)素的利用效果遠(yuǎn)低于纖維素，貪銅菌Cupriavidus basilensis B-8利用處理后的木質(zhì)素合成PHAs得率僅482.7 mg/L。

2.2.2 甘蔗煉糖行業(yè)廉價(jià)碳源

甘蔗煉糖行業(yè)中的副產(chǎn)物糖蜜和蔗渣都是生產(chǎn)低成本PHAs的理想碳源。以稀釋后的甘蔗糖蜜為碳源，枯草芽孢桿菌B.subtilis RS1經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵后生物量達(dá)到9.5 g/L，PHAs含量達(dá)到生物量的70.5%。另一株B.subtilis以酸處理后的甘蔗糖蜜為碳源，經(jīng)過(guò)96 h發(fā)酵后生物量達(dá)到38.98 g/L，PHAs含量32.25 g/L，PHAs占生物量82.99%。相比于糖蜜，蔗渣的利用難度稍大。蔗渣經(jīng)酸水解后除木糖(16.9 g/L)和葡萄糖(9.7 g/L)外還含有糠醛、乙酸等毒性物質(zhì)。在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行的分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明洋蔥伯克氏菌Burkholderia cepacia IPT 048和B.sacchari IPT 101可以利用蔗渣水解液發(fā)酵生產(chǎn)PHAs，且這兩株菌的生物量都達(dá)到4.4 g/L，其中PHAs含量分別達(dá)到生物量的53%和62%。當(dāng)僅以木糖和葡萄糖作為混合碳源時(shí)，這兩株菌株的生物量都能夠達(dá)到60 g/L，PHAs含量占比60%。這表明蔗渣水解液中的毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞積累PHAs影響極大，是未來(lái)實(shí)現(xiàn)高效利用蔗渣水解液的阻礙之一。

2.2.3 生物柴油行業(yè)廉價(jià)碳源

生物柴油行業(yè)每生產(chǎn)100 kg生物柴油將產(chǎn)生10 kg粗甘油，其中甘油占比75%。據(jù)報(bào)道鉤蟲貪銅菌C.necator DSM 545可以以粗甘油為底物合成PHB，盡管占比可以達(dá)到生物量的59.8%，但是生物量只有5.7 g/L。此外DSM 545可以將丙酮酸和粗甘油作為共同碳源合成P(3HB-4HB-3HV)，其中生物量達(dá)到45 g/L，PHAs產(chǎn)量達(dá)到16.7 g/L，PHAs占比36.9%。同樣地，蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis EGU45直接利用粗甘油可以實(shí)現(xiàn)3.16 g/L生物量和1.83 g/L PHAs的積累。研究結(jié)果證明粗甘油可以作為PHAs生產(chǎn)的廉價(jià)碳源，尤其是其產(chǎn)量大、成本低以及環(huán)境無(wú)污染等特性，都為生產(chǎn)低成本PHAs提供了可能性。但是目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用粗甘油無(wú)法達(dá)到PHAs的高產(chǎn)量積累，通過(guò)基因工程手段或發(fā)酵調(diào)控策略提高粗甘油利用率或許是未來(lái)實(shí)現(xiàn)粗甘油利用的發(fā)展方向之一。

2.2.4 廢水廢料

工農(nóng)業(yè)廢水廢料中富含的有機(jī)質(zhì)通過(guò)酸化或厭氧發(fā)酵后轉(zhuǎn)化成的揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFAs)，是微生物生產(chǎn)PHAs的高效廉價(jià)碳源。在1 L發(fā)酵罐中，R.eutropha H16能夠?qū)⒐まr(nóng)業(yè)廢水轉(zhuǎn)化的VFAs作為碳源和底物能量完成P(3HB-co-3HV)的積累。經(jīng)48 h發(fā)酵后，生物量達(dá)到112 g/L，其中PHAs占比83.3%。在江蘇省無(wú)錫市蘆村進(jìn)行的100 L發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn)中，Jia等同樣利用酸化后的污水沉淀物實(shí)現(xiàn)了PHAs的微生物轉(zhuǎn)化，其中PHAs產(chǎn)量可以達(dá)到生物量的59.47%。除工農(nóng)業(yè)廢水廢料外，生活產(chǎn)生的廢棄生物質(zhì)，例如豌豆皮、土豆皮、洋蔥皮等[30]生物質(zhì)資源經(jīng)酸化后同樣可以轉(zhuǎn)化為VFAs，最后用于低成本PHAs的生產(chǎn)。

除此之外，表1中還列舉了其他可以用于低成本PHAs生產(chǎn)的碳源，例如石油煉制過(guò)程中的甲苯、乙苯、二甲苯等苯系化合物、奶酪加工過(guò)程中的乳清，油炸食品加工過(guò)程中的廢棄橄欖油、棕櫚油、葵花籽油等植物油。用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)低成本PHAs的理想碳源種類豐富，其中來(lái)自農(nóng)業(yè)、工業(yè)、城市排放和餐余垃圾的廢棄物料來(lái)源廣、體量大，更適用于低成本PHAs的生產(chǎn)。但是大部分廉價(jià)物料經(jīng)預(yù)處理后碳源濃度低、碳源成分復(fù)雜多樣、毒性化合物存在、生物量低等問(wèn)題為后期發(fā)酵策略的開發(fā)提出了新的挑戰(zhàn)。

2.3 高密度發(fā)酵策略調(diào)控

實(shí)現(xiàn)PHAs的高密度發(fā)酵是生產(chǎn)低成本PHAs的必要條件之一。當(dāng)PHAs產(chǎn)量相同時(shí)，高密度發(fā)酵所需的發(fā)酵體積更少，在人工成本、設(shè)備成本和能源消耗上都會(huì)有明顯降低。

2.3.1 高密度發(fā)酵策略

PHAs的高密度發(fā)酵主要圍繞“飽-饑”策略展開，即通過(guò)控制特定營(yíng)養(yǎng)元素的濃度實(shí)現(xiàn)菌株先積累生物量再積累PHAs的多階段發(fā)酵調(diào)控。補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)和連續(xù)發(fā)酵技術(shù)是實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵最常用的兩個(gè)技術(shù)手段。Huschner等以氮元素為營(yíng)養(yǎng)限制條件，按照0–16 h C/N=10、16–36 h C/N=90和36–48 h C/N=∞(乙酸330.9 g/L、丙酸147.3 g/L、丁酸106.7 g/L)的調(diào)控策略實(shí)現(xiàn)了R.eutropha H16的高密度發(fā)酵，其中生物量達(dá)到112 g/L，PHAs占比83.3%。Ye等同樣以氮元素為限制條件實(shí)現(xiàn)了H.bluephagenesis TD01發(fā)酵過(guò)程的精準(zhǔn)控制。發(fā)酵18 h時(shí)TD01細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1010個(gè)并在隨后的發(fā)酵過(guò)程中保持不變，后續(xù)流加的高濃度葡萄糖(800 g/L)全部用于PHAs合成。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后TD01生物量達(dá)到90 g/L，PHAs占比74%。

Atlic等利用5級(jí)連續(xù)發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)了C.necator DSM545的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，其中流出發(fā)酵液的生物量81 g/L，PHAs占比77%。5級(jí)連續(xù)發(fā)酵罐中的第一個(gè)發(fā)酵罐用于DSM545菌體數(shù)量的培養(yǎng)，其余發(fā)酵罐均用于氮元素限制下的PHA積累，PHAs生產(chǎn)速率達(dá)到1.85 g/(L·h)(補(bǔ)料中葡萄糖濃度500 g/L)。上述策略中都要求使用高濃度補(bǔ)料液以減少對(duì)發(fā)酵體系的影響，顯然纖維素水解液、粗甘油等低碳濃度的廉價(jià)物料無(wú)法滿足這一要求。于是Haas等開發(fā)了一種含有微濾膜出口的發(fā)酵罐，發(fā)酵清液經(jīng)微濾膜出口流出，細(xì)胞則被保留在發(fā)酵罐中。當(dāng)以50 g/L的葡萄糖作為補(bǔ)料液時(shí)得到生物量148 g/L，PHB占比76%的結(jié)果。這一策略巧妙地避免了低糖濃度補(bǔ)料導(dǎo)致的發(fā)酵體積增大、細(xì)胞逃逸等問(wèn)題，尤其是為后期開發(fā)利用低濃度廉價(jià)碳源提供了思路。

2.3.2 碳源濃度控制

高密度發(fā)酵過(guò)程中碳源濃度過(guò)高過(guò)低或頻繁波動(dòng)都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞PHAs合成的能力。Shang等發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度保持9 g/L時(shí)R.eutropha可以表現(xiàn)出優(yōu)異的PHAs積累能力，而當(dāng)葡萄糖濃度在8–12 g/L范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，PHAs的積累量也會(huì)出現(xiàn)2%的波動(dòng)。Alcaligenes eutrophus NCIMB11599、H.bluephagenesis TD01等菌株也被證實(shí)在發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為10 g/L，即接近于其半速系數(shù)時(shí)，菌株可以實(shí)現(xiàn)PHAs的高效合成。結(jié)果表明控制發(fā)酵液中的碳源濃度，有利于提高高密度發(fā)酵過(guò)程中的PHAs積累量。

2.3.3 溶氧水平控制

溶氧水平是影響高密度發(fā)酵的重要因素之一。高密度發(fā)酵后期溶氧量急速降低形成微氧或無(wú)氧環(huán)境，PHAs合成代謝途徑受抑制，積累量降低。盡管提高攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量或者供給富氧空氣可以保證高密度發(fā)酵后期的溶氧水平，但是這些舉措增加了PHAs的生產(chǎn)成本?；蚬こ淌侄蔚膽?yīng)用解決了菌株在微氧情況下的適應(yīng)問(wèn)題。例如導(dǎo)入乙醇脫氫酶啟動(dòng)子Padh E的重組E.coli JW2294在微氧環(huán)境中實(shí)現(xiàn)了7.8 g/L生物量，64%PHB的積累。導(dǎo)入由8個(gè)透明顫菌血紅蛋白啟動(dòng)子串聯(lián)的P8vgb片段的重組E.coli S17-1在微氧環(huán)境中的PHB占比達(dá)到90%。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)在重組Halomonas sp.LS21中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白可以提高細(xì)胞在微氧環(huán)境中對(duì)氧氣的攝取能力，發(fā)酵結(jié)束后生物量達(dá)到30.21 g/L，PHB占比75.32%。由此可見利用微氧啟動(dòng)子、或者提高細(xì)胞對(duì)氧氣的攝取能力都可以維持細(xì)胞在微氧環(huán)境下的胞內(nèi)正常代謝表達(dá)。

2.3.4 毒性物質(zhì)影響

毒性物質(zhì)積累是影響高密度發(fā)酵的另一個(gè)重要因素。高密度發(fā)酵過(guò)程中毒性物質(zhì)的不斷積累導(dǎo)致細(xì)胞活力降低甚至死亡，最終影響發(fā)酵產(chǎn)量。連續(xù)傳代進(jìn)化是目前提高菌株耐受性最常用、也是最有效的方法。為了解決乙酸、乳酸、富馬酸和甲醇富集導(dǎo)致菌株代謝能力降低的問(wèn)題，人造高密度發(fā)酵體系被用于H.bluephagenesis TDHCD-R0的連續(xù)傳代進(jìn)化。經(jīng)過(guò)3輪篩選后的TDHCD-R3在生物量和PHAs積累方面出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)。相比于出發(fā)菌株，TDHCD-R3生物量提高了41.7%，PHAs產(chǎn)量提高了8.2%。連續(xù)傳代進(jìn)化同樣適用于微生物菌群的優(yōu)化?？梢愿咝Ю帽本┦行〖t門污水處理廠廢液廢料的微生物菌群經(jīng)過(guò)4輪連續(xù)傳代進(jìn)化后才適用于江蘇省無(wú)錫市蘆村污水處理廠廢液廢料，其中PHAs積累量達(dá)到菌體生物量的59.47%，遠(yuǎn)高于出發(fā)微生物菌群的PHAs占比(21.5%)。微生物菌群的連續(xù)傳代進(jìn)化可以優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)、提高底物選擇能力，甚至菌群在過(guò)量氮源和非VFA存在情況下不積累PHAs的現(xiàn)象都得到了緩解。

2.4 開放式發(fā)酵策略開發(fā)

微生物發(fā)酵法產(chǎn)PHAs過(guò)程中能源消耗的費(fèi)用占總成本的30%，其中主要集中于無(wú)菌化處理過(guò)程，如設(shè)備滅菌、培養(yǎng)基滅菌等的蒸汽消耗。因此有研究者提出“下一代工業(yè)生物技術(shù)(Next-generation industrial biotechnology，NGIB)”，即一種開放式連續(xù)發(fā)酵生物工業(yè)技術(shù)。

目前NGIB中成功用于PHAs生產(chǎn)的Halomonas sp.TD01是清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)從艾丁湖篩選獲得的耐鹽耐堿菌株，在高鹽高堿的環(huán)境下可以保持PHAs的高效合成。鹽單胞菌TD01已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了中試級(jí)別的開放式補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵，這一過(guò)程中發(fā)酵物料、設(shè)備以及補(bǔ)料無(wú)需進(jìn)行滅菌操作，大大減少了滅菌過(guò)程的能源消耗。另一株嗜鹽菌H.campaniensis LS21以按照廚余垃圾和海水成分配制的模擬培養(yǎng)基(其中Na Cl濃度為27 g/L，p H為10)實(shí)現(xiàn)了連續(xù)65 d的開放式發(fā)酵，經(jīng)基因工程改造后的重組H.campaniensis LS21在同樣條件下實(shí)現(xiàn)了生物量70%的PHB積累。這為未來(lái)直接利用廚余垃圾和海水進(jìn)行開放式無(wú)滅菌發(fā)酵提供了可能性。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程及下游分離提取過(guò)程中產(chǎn)生的高鹽廢水在無(wú)需預(yù)處理的情況下可以再次實(shí)現(xiàn)4批次的PHAs發(fā)酵。這不但減少了新水及Na Cl的使用量，還同時(shí)解決了高鹽高堿發(fā)酵廢水的處理排放問(wèn)題。

NGIB的核心是獲得一株可以抵抗噬菌體或其他菌種感染的底盤微生物。因此可以用于開發(fā)生產(chǎn)PHA的底盤微生物種類繁多，例如在高堿無(wú)滅菌培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇的耐鹽堿馬氏芽孢桿菌Bacillus marmarensis、在50℃高溫?zé)o滅菌培養(yǎng)基中生產(chǎn)乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans WCP10-4等，以及自然界中存在的嗜酸、嗜堿等嗜極微生物都可以開發(fā)用作低成本PHAs發(fā)酵生產(chǎn)的底盤微生物。

3 展望

隨著白色污染的加重和石油資源的枯竭，綠色環(huán)保材料必將取代傳統(tǒng)石油基塑料。被認(rèn)為是未來(lái)最有前景的綠色環(huán)保材料PHAs由于其高昂的生產(chǎn)成本在推廣應(yīng)用中受到了極大的限制，因此實(shí)現(xiàn)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)是目前的研究重點(diǎn)。目前利用合成生物學(xué)、基因工程以及代謝工程等手段，菌株合成PHAs的能力已經(jīng)得到明顯提升，但依然無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。未來(lái)的研究方向?qū)⒅饕械絻蓚€(gè)方面：(1)開發(fā)低成本物料利用技術(shù)。例如利用農(nóng)業(yè)秸稈、餐余垃圾和廢水廢料等廢棄物料，降低PHAs發(fā)酵生產(chǎn)的物料成本。(2)開發(fā)NGIB。尋找高效積累PHA的嗜極微生物，實(shí)現(xiàn)PHAs的開放式發(fā)酵生產(chǎn)，能夠進(jìn)一步推動(dòng)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《生物工程學(xué)報(bào)》2021年2月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

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