隨著人們生活質(zhì)量的提高和對食品營養(yǎng)保健功能認(rèn)識的加強(qiáng),我國食用植物油的需求不斷增加,油菜是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一,菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸,而且能較長時間地儲存,為了更好地滿足廣大人民對優(yōu)質(zhì)食用植物油的需求,菜籽油品質(zhì)改良已成為當(dāng)前油菜育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

菜籽油的主要成分是脂肪酸,油脂的優(yōu)劣由脂肪酸決定,而油脂脂肪酸的好壞則主要取決于其碳?xì)滏滐柡统潭?。脂肪酸根?jù)碳?xì)滏滐柡团c不飽和分為3類:飽和脂肪酸(主要有棕櫚酸、硬脂酸等)、單不飽和脂肪酸(油酸、芥酸等)和多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等),有研究表明,預(yù)防冠心病的指導(dǎo)方針集中在將飲食中的飽和脂肪和反式脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)椴伙柡椭?飽和脂肪酸熔點(diǎn)較高,易凝固在血管壁上,從而導(dǎo)致高血壓和動脈粥樣硬化,且飽和脂肪酸還導(dǎo)致血膽固醇濃度上升,不飽和脂肪酸熔點(diǎn)較低,容易被人體吸收。

本研究以湖南省水稻油菜抗病重點(diǎn)實驗室前期對高亞麻酸甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)近等基因系進(jìn)行的miRNA測序結(jié)果為基礎(chǔ),篩選到的與脂肪酸代謝相關(guān)的bna-miR396及其靶基因乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,AT通過催化乙酰基團(tuán)從乙酰輔酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)轉(zhuǎn)移到其作用底物芳香胺及雜環(huán)胺類物質(zhì)上,參與脂肪酸轉(zhuǎn)化與降解,AT缺失會推遲植物開花時間并降低育性。利用同源基因克隆,得到AT基因的2個拷貝,分別構(gòu)建過表達(dá)載體與干擾載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,分析轉(zhuǎn)基因擬南芥后代種子脂肪酸組成,探究該基因在脂肪酸合成過程的功能,以期促進(jìn)甘藍(lán)型油菜脂肪合成分子機(jī)理研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

高亞麻酸甘藍(lán)型油菜近等基因系（低亞麻酸株系575，亞麻酸含量為5.1%；高亞麻酸株系574，亞麻酸含量9.8%),野生型擬南芥(WT)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家油料改良中心提供。大腸桿菌感受態(tài)DH5α,限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4DNALigationKit購自北京擎科生物科技有限公司；pMD18-T載體由本實驗室保存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi載體購于上?？殿伾锟萍加邢薰?；本試驗中所用到的引物均由北京擎科合成。

1.2 AT基因克隆

利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,發(fā)現(xiàn)AT基因有2個拷貝,分別在A基因組和C基因組,并以此序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)進(jìn)行后續(xù)引物設(shè)計(表1),其中5′端酶切位點(diǎn)前的序列用于重組連接。

采用TransZolUP植物總RNA提取試劑盒(北京全式金)提取低亞麻酸甘藍(lán)型油菜株系575自交授粉后20～35d混合種子總RNA,并用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金)合成cDNA第一鏈,以此為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系包含KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反向引物各0.2μmol/L,cDNA小于500ng,用ddH2O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件為98℃2min預(yù)變性；98℃10s,60℃30s,68℃2min,35個循環(huán)；68℃7min延伸。

經(jīng)PCR純化回收后，與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，由北京擎科公司進(jìn)行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

用SnapGene3.2.1將克隆到的靶基因序列翻譯成氨基酸，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP進(jìn)行鑒定后,預(yù)測對應(yīng)蛋白的一級結(jié)構(gòu),包括氨基酸組成、理化性質(zhì)等；分別登錄PredictProtein、SOPMATMHMM網(wǎng)站進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測、結(jié)構(gòu)預(yù)測、跨膜螺旋區(qū)分析；通過SWISS-MQPEL構(gòu)建蛋白三級結(jié)構(gòu)模型。

1.5 過表達(dá)載體與RNAi干擾載體構(gòu)建

用BamHI和SalI雙酶切pCambia1300-35s-N1載體,膠回收，產(chǎn)物進(jìn)行體外同源重組反應(yīng),獲得重組質(zhì)粒。

用XbaI及BamHI雙酶切pCambial300-RNAi載體以及各個基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物,具體方法參考劉芳等,并進(jìn)行改進(jìn),膠回收后進(jìn)行連接,獲得重組質(zhì)粒。測序檢驗正確后,用PstI和Sal.I雙酶切重組質(zhì)粒及各個基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物,再次進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,獲得最終的RNAi載體。

將構(gòu)建好的過表達(dá)載體與RNAi干擾載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,以野生型擬南芥為受體,進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化,獲得T₀種子；用潮霉素篩選T₀擬南芥陽性苗并種植,之后，用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因苗,收取得到T₁種子。

1.6 脂肪酸成分測定

采用SP-6890型氣相色譜儀、FID檢測器、N3000色譜工作站、毛細(xì)管色譜柱DB-23對轉(zhuǎn)基因擬南芥T₁種子進(jìn)行脂肪酸成分測定,對7個主要的脂肪酸成分進(jìn)行分析,測定時取5個轉(zhuǎn)基因后代株系,每個材料檢測約30粒種子。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因與特異干擾片段克隆及檢測結(jié)果

以低亞麻酸甘藍(lán)型油菜20～35d自交種cDNA為模板,高保真擴(kuò)增了乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的2個拷貝,大小均為1350bp。分別對2個靶基因特異片段進(jìn)行PCR高保真擴(kuò)增,得到了目的片段長度大小的DNA片段。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

以SnapGene3.2.1分別對AT基因翻譯出來的氨基酸序列,通過ExPASy-ProtParamtool進(jìn)行理化性質(zhì)分析表明(表3),AT基因的2個拷貝114與148氨基酸均為449個，分子量約50.5ku,114編碼的氨基酸偏中性而148編碼的蛋白偏堿性。不穩(wěn)定系數(shù)顯示114與148均為穩(wěn)定蛋白,且親水性較差，屬于脂溶性蛋白。

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