藜麥,原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)的一種偽谷物,一年生,葉子較寬,自花授粉。藜麥具有耐寒、耐旱、耐鹽堿和生長在貧瘠土壤的能力。藜麥不含麩質(zhì),是素食主義者的理想食品。藜麥是一種全蛋白食品,蛋白質(zhì)含量高達12%~23%,且氨基酸含量豐富,其中賴氨酸含量是普通谷物的2倍,氨基酸組成接近FAO推薦的理想蛋白比例,是一種很好的植物蛋白來源。
藜麥富含淀粉、脂肪、膳食纖維和多種營養(yǎng)元素,有著“營養(yǎng)黃金”之稱。藜麥及其種子可用于啤酒釀造,藜麥芽可加入沙拉中食用,此外,藜麥還可用于味噌、醬粉、黃酒、飲料、餅干、面包等調(diào)味品和食品的制作。藜麥具有多種化學成分,包括皂素、植物甾醇、植物蛻皮激素、酚類物質(zhì)和生物活性肽。因此,藜麥是一種功能性食品。
是一種功能性食品。研究表明,藜麥多肽液具有抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性、降血糖等作用。目前,對藜麥的相關(guān)研究主要集中在黃酮、多酚、蛋白等提取分離和相關(guān)活性研究上,酶解藜麥蛋白制備功能活性肽的報道較少,VilcacundoR等模擬人體胃腸環(huán)境消化藜麥蛋白,分離出具有抑制二肽酶IV、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶活性肽鏈。田旭靜等以風味蛋白酶和堿性蛋白酶為1:1酶解藜麥糠蛋白制備抗氧化肽,其活性與劑量呈量效關(guān)系。
實驗利用藜麥為材料,提取蛋白進行酶解,以酶解后的多肽液對α-淀粉酶的抑制率為評價指標,篩選出最佳蛋白酶,通過酶解條件優(yōu)化實驗獲得最佳酶解工藝條件,為藜麥的相關(guān)研究和保健酒類飲料的開發(fā)及應(yīng)用提供了參考。
一、材料與方法
1、材料與試劑
藜麥:粉碎過60目篩脫脂、烘干,山西稼祺藜麥開發(fā)有限公司;牛血清蛋白:武漢華順試劑耗材有限公司;正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、可溶性淀粉:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;中性蛋白酶(100U/mg)、堿性蛋白酶(200U/mg)、風味蛋白酶(20u/mg)、胰蛋白酶(250u/mg)、α-淀粉酶(2×104U/mL,用pH6.9的磷酸鹽緩沖溶液配成10u/mL使用):上海源葉生物科技有限公司。
2、儀器與設(shè)備
AR313電子天平、FE20pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HK-04A粉碎機,廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司;Multifugex1R高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技(上海)有限公司;UV-1000分光光度計,日本島津科技有限公司;85-2型磁力攪拌機,上海司樂儀器有限公司。
3、方法
(1)藜麥蛋白酶解工藝
稱取一定量粉碎脫脂后的藜麥粉,采用堿溶酸沉法提取藜麥粗蛋白,將提取的粗蛋白樣品配制成1%質(zhì)量濃度的蛋白液,分別用不同的蛋白酶進行酶解,酶解完后沸水浴滅酶10min,冷卻,以8000r/min離心10min,收集上清液測其多肽含量,比較不同酶解條件制備的酶解液對α-淀粉酶活性的抑制率,以研究藜麥多肽制備的酶解工藝。
(2)檢測方法
①多肽含量及得率測定
采用雙縮脲法繪制牛血清蛋白標準曲線。
多肽液樣品多肽含量的檢測:取3mL樣品溶液加入3mL15%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液于漩渦混合儀上混合均勻,然后在10000r/min下離心10min,取上清液于540nm下測定OD值,對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(g/L),進而可求得樣品中的多肽含量。
②藜麥多肽液對α-淀粉酶活性抑制率的測定
樣品管:取0.5mL離心后的多肽液和等量的10U/mLα-淀粉酶溶液于37℃加熱10min,然后加入2%可溶性淀粉1mL,反應(yīng)5min,加入DNS試劑1mL,沸水浴5min冷卻,稀釋至25mL,于520nm測定吸光度OD。對照管:用蒸餾水代替多肽液,記作OD,,以蒸餾水代替淀粉液作空白,記作OD”。
(3)藜麥蛋白酶解工藝優(yōu)化
①蛋白酶的篩選
選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶4種蛋白酶分別進行初步水解。水解條件:藜麥蛋白質(zhì)量濃度1%,加酶量0.3×104U/g,在不同蛋白酶各自最適pH和溫度條件下酶解(見表1),酶解時間為60min,以多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率為評價指標,篩選出多肽得率高且活性抑制率高的蛋白酶,進行下一步試驗。
②藜麥蛋白酶解單因素試驗
酶解時問對α-淀粉酶活性抑制率的影響:稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份,分別加入50mL的水配制成1%的蛋白溶液,在pH8.0、溫度50℃、加酶量0.3×104U/g的條件下分別酶解1,1.5,2,2.5,3h。
酶解溫度對α-淀粉酶活性抑制率的影響:稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份,分別加入50mL的水配制成1%的蛋白溶液,在溫度30,40,50,60,70℃、pH8.0、加酶量0.3×104U/g的條件下酶解2h。
pH對α-淀粉酶活性抑制率的影響:稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份,分別加入50mL的水配制成1%的蛋白溶液,設(shè)定酶解溫度50℃,加酶量0.3×104U/g,分別在pH6,7,8,9,10的條件下酶解2h。
加酶量對α-淀粉酶活性抑制率的影響:稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份,加入50mL的水配制成1%的蛋白溶液,設(shè)定pH8,溫度50℃,分別在加酶量0.2×104,0.3×104,0.4×104,0.5×104,0.6×104U/g的條件下酶解2h。
(4)響應(yīng)面試驗
依據(jù)蛋白酶解工藝的單因素試驗結(jié)果,以溫度、pH、加酶量、酶解時間4個因素為自變量,以曠淀粉酶活性抑制率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法四因素三水平試驗進行優(yōu)化,按照BoX-Behnken原理進行試驗設(shè)計。
(5)數(shù)據(jù)處理
采用Orign8.5、DesignExpert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。
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