郫縣豆瓣是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，迄今已有300余年的歷史，因其鮮辣醇厚、紅棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠絨實(shí)、醬香濃郁的產(chǎn)品特點(diǎn)，在我國餐廚中得以廣泛使用，被譽(yù)為“川菜之魂”。郫縣豆瓣的傳統(tǒng)制作工藝被列為國家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，其生產(chǎn)主要包括辣椒自然發(fā)酵、蠶豆接種發(fā)酵和混合后熟發(fā)酵3個(gè)階段，通過獨(dú)特的“晴天曬、雨天蓋、白天翻、夜晚露”的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，形成郫縣豆瓣獨(dú)特的風(fēng)味特征。近年來，國內(nèi)學(xué)者從郫縣豆瓣香氣成分中鑒定出百余種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等，它們之間的相互作用共同決定了郫縣豆瓣的香氣構(gòu)型。然而，目前相關(guān)研究主要集中在不同發(fā)酵時(shí)間或不同品牌產(chǎn)品風(fēng)味的比較，對這些風(fēng)味成分在郫縣豆瓣整個(gè)生產(chǎn)周期的演變規(guī)律以及郫縣豆瓣香型和特征香氣化合物的相關(guān)性仍缺乏系統(tǒng)研究。

基于此，本研究的主要目的：1）采用描述性感官分析法評(píng)價(jià)郫縣豆瓣釀制不同階段的香氣屬性；2）采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）結(jié)合稀釋分析（GC-O）鑒定郫縣豆瓣典型的特征香氣化合物；3）通過多元數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法（PLSR）分析揮發(fā)性化合物對郫縣豆瓣香型的影響及演變規(guī)律。本研究結(jié)果有助于郫縣豆瓣產(chǎn)品品質(zhì)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

郫縣豆瓣發(fā)酵過程各樣品取自四川郫縣某豆瓣公司，其釀制主要分為辣椒發(fā)酵、蠶豆發(fā)酵（制曲+曲料發(fā)酵）和混合發(fā)酵3個(gè)階段，如圖1所示，各發(fā)酵階段主要參數(shù)如下所述。

辣椒發(fā)酵：辣椒（CapsicumannuumL.）經(jīng)挑選、清洗等預(yù)處理后，加入16%～18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）食鹽，經(jīng)自然發(fā)酵6個(gè)月制得辣椒胚。

蠶豆發(fā)酵：蠶豆（ViciafabaL.）經(jīng)挑選、脫殼、浸泡等預(yù)處理后與少量面粉（TriticumaestivumL.）、米曲霉（滬釀3.042）拌和，在37℃條件下制曲48h，隨后加入12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的食鹽和20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水，在30～32℃保溫發(fā)酵4個(gè)月制得甜瓣子。

混合發(fā)酵：將上述制備成熟的辣椒胚和甜瓣子按質(zhì)量比3:1混合后在自然條件下發(fā)酵（翻、曬、露）12個(gè)月制得郫縣豆瓣。

本試驗(yàn)共有7個(gè)取樣點(diǎn)，分別為：蠶豆（Broadbean）、鮮辣椒（Freshchili）、曲料（Koji）、甜瓣子（Doubanjiang-meju）、辣椒胚（Chilimoromi）、混合發(fā)酵初期（發(fā)酵1周，Theinitialmixture）、郫縣豆瓣（Pixian-douban）。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙酸苯乙酯（Analyticalstandard）、正構(gòu)烷烴（C7-C30），德國Sigma-Aldrich公司；其它試劑均為分析純級(jí)，成都科隆試劑有限公司。

1.3 儀器及設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海大顏儀器設(shè)備有限公司；QP2010SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、OP275嗅聞儀，日本島津儀器有限公司。

1.4 揮發(fā)性化合物的萃取及分析條件

準(zhǔn)確稱取5.0g樣品（預(yù)先研磨均勻）于20mL頂空瓶中，添加20μL內(nèi)標(biāo)（10μg/mL乙酸苯乙酯甲醇溶液）。將頂空瓶置于50℃預(yù)平衡30min，插入DＶB/CAR/PDMS萃取頭（萃取頭提前在GC進(jìn)樣口270℃老化30min），然后在50℃條件下萃取30min，萃取結(jié)束后于GC進(jìn)樣口解析5min，2個(gè)樣品間萃取頭在同樣條件下老化10min以防止樣品間相互污染。
儀器設(shè)備采用GCMS-QP2010SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ShimadzuCo，Kyoto，Japan），配備AgilentDB-5MS氣相色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，J&WScientific，F(xiàn)olsom，CA）；載氣為高純氦氣，流速1.0mL/min；采用電子轟擊電離（EI）離子源，電子能量70eＶ；離子掃描范圍33～400m/z；離子源溫度230℃，接口溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃；根據(jù)特定條件設(shè)定分離比。程序升溫條件：初始溫度40℃，保持3min；然后以3℃/min升到150℃，再以6℃/min升到240℃維持6min。

1.5 揮發(fā)性化合物的鑒定與定量

化合物的鑒定根據(jù)Wiley和NIST14數(shù)據(jù)庫檢索確定初步結(jié)果，隨后采用DB-5MS色譜柱上所得到的保留指數(shù)（Retentionindex，RI）進(jìn)行定性，通過比對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RI并參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確定?；衔锏腞I通過正構(gòu)烷烴（C7-C30）計(jì)算得到。線性程序升溫時(shí)，保留指數(shù)RI的計(jì)算方法見式（1）。

式中，t（a）—待測組分a的保留時(shí)間（mim）；n和n+1—待測組分a流出前、后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；t（n）和t（n+1）—具有n和n+1個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間（min）。

定量方法：采用內(nèi)標(biāo)法（以乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)）對郫縣豆瓣中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析，計(jì)算方法見式（2）。

式中，Wi—待測組分i的含量（μg/kg）；Ws—加入內(nèi)標(biāo)s的含量（μg/kg）；Ai和As—待測組分i和內(nèi)標(biāo)s的峰面積（a.u.）；f'—待測組分i對內(nèi)標(biāo)s的相對質(zhì)量校正因子，本文假定各待測組分i的相對校正因子f'均為1。

1.6 特征揮發(fā)性物質(zhì)分析

特征揮發(fā)性物質(zhì)分析采用香味萃取稀釋法，評(píng)價(jià)方法參照馮云子等報(bào)道：挑選3位評(píng)價(jià)員，預(yù)先經(jīng)過風(fēng)味感官認(rèn)識(shí)、樣品感官和GC-O嗅聞等培訓(xùn)。評(píng)價(jià)員通過不斷嗅聞原萃取物的梯度稀釋樣品而得到稀釋因子FD（可被GC-O嗅聞試驗(yàn)檢測到的最高稀釋倍數(shù)），本試驗(yàn)稀釋梯度設(shè)置為1:1，1:5，1:10，1:25，1:50，1:100和1:200。評(píng)價(jià)員對每個(gè)樣品重復(fù)嗅聞2～3次，并在嗅聞到氣味的同時(shí)對嗅聞時(shí)間及氣味強(qiáng)度在軟件上進(jìn)行記錄，香味特性由另1名有經(jīng)驗(yàn)的研究人員進(jìn)行記錄。本文采用檢測頻率的方法來獲得郫縣豆瓣的特征揮發(fā)性物質(zhì)，將分流比在1:10以上由至少2位評(píng)價(jià)員每次都嗅聞得到的物質(zhì)定義為特征揮發(fā)性物質(zhì)。

1.7 香氣感官評(píng)價(jià)方法

樣品的香氣評(píng)價(jià)由10位經(jīng)過感官評(píng)價(jià)技術(shù)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員（4男6女，年齡在20～30歲），采用十點(diǎn)制的定量描述感官分析法評(píng)價(jià)。20g樣品置于編碼的帶蓋塑料杯中，評(píng)價(jià)員嗅聞，樣品隨機(jī)放置，每個(gè)樣品每人嗅聞3次。感官評(píng)價(jià)技術(shù)訓(xùn)練參照GB/T15549-1995，感官評(píng)價(jià)試驗(yàn)在恒溫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，遵守國際實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)。首先，評(píng)價(jià)員分別給出郫縣豆瓣香氣的感官屬性，討論不同的香氣標(biāo)準(zhǔn)，并選取8種最重要的香氣特征（醇香、酸香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、醬香和辛辣味）作進(jìn)一步分析；然后評(píng)價(jià)員采用十點(diǎn)制（0表示嗅聞不到，10表示非常濃郁）對各樣品的香氣進(jìn)行感官評(píng)分，香氣參考標(biāo)準(zhǔn)如下：醇香（體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇水溶液）、酸香（體積分?jǐn)?shù)10%的乙酸水溶液）、花香（1mg/mL苯乙醇溶液）、果香（1mg/mL乙酸苯乙酯溶液，溶劑為體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇水溶液）、焦糖香（0.1g/mL焦糖水溶液）、醬香（0.1g/mL醬油水溶液）、辛辣味[含10g鮮辣椒（CapsicumannuumL.）的100mL水溶液]、煙熏香（1mg/mL4-乙基愈創(chuàng)木酚溶液，溶劑為體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇水溶液）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析；通過Unscrambler10.4（Camo公司，挪威）軟件進(jìn)行PLSR分析，所有的變量均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化（1/Sdev）處理。

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