目前，國內(nèi)外的納豆相關(guān)食品種類很多，如納豆復合飲料、納豆咀嚼片、納豆壓片糖果等。納豆芽孢桿菌與益生菌類似，在生長繁殖過程中可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物：①多種活性抗菌物質(zhì)，可以有效地抑制沙門氏菌等多種致病菌，能夠促進消化，增強免疫力；②維生素類物質(zhì)，如維生素K2可以與寡糖偶合，從而使機體更有效地利用營養(yǎng)物質(zhì)；③)γ-多聚谷氨酸(γ-PGA)，在抑菌包裝方面具有很大的利用價值；④低聚果糖，可用作可食用淀粉薄膜的功能性成分；⑤納豆激酶，具有高纖維蛋白溶解活性，可用作心血管疾病的治療藥物。由于分子量較低且對pH低的環(huán)境穩(wěn)定性高，因此可用于口服。由于能夠產(chǎn)生如此眾多的活性物質(zhì)和功能性物質(zhì)，因而納豆芽孢桿菌具有多種利用價值，可作為食品防腐劑、微生態(tài)制劑、抗菌劑、免疫增強劑等。

牡蠣的蛋白質(zhì)含量高，維生素、鋅的含量豐富，具有高營養(yǎng)價值。但生牡蠣可能含有有害細菌，例如副溶血性弧菌和沙門氏菌都是常見的食源性病原菌，因此生食牡蠣有一定的安全隱患。本文以牡蠣為原料，通過納豆芽孢桿菌發(fā)酵制得的富含氨基酸類物質(zhì)的發(fā)酵液經(jīng)濃縮后可用于開發(fā)營養(yǎng)口服液，也可用于生物肥料、動物飼料等，能夠降低牡蠣及其制品生食潛在的安全隱患，同時提高牡蠣加工利用可能性，提高牡蠣經(jīng)濟附加值。

一、材料與方法

1、材料

牡蠣：市售；納豆菌發(fā)酵粉：上海賀普實業(yè)有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，國藥集團化學試劑有限公司。

2、儀器與設備

DH-600AB電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；722紫外分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司。

3、方法

（1）納豆芽孢桿菌的活化及純化

納豆芽孢桿菌的活化和純化參照宋光艷的操作過程。于無菌條件下取0.3g的納豆芽孢桿菌發(fā)酵粉于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)24h，然后用移液槍吸取1mL菌懸液至LB液體培養(yǎng)基試管中轉(zhuǎn)接2代恢復菌種活力。于無菌條件下將活化后的納豆芽孢桿菌進行純化，37℃培養(yǎng)24h，然后在無菌條件下挑取形態(tài)良好的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基試管中，在37℃的條件下培養(yǎng)24h，最后將菌種轉(zhuǎn)接至LB固體斜面培養(yǎng)基中并于4℃條件下冷藏保存。

（2）牡蠣發(fā)酵培養(yǎng)基制備

牡蠣肉解凍，清洗干凈，除去雜質(zhì)，在料理機中打成糊狀，分裝至250mL錐形瓶中，固定料液比1:4(g／mL)、發(fā)酵溫度37℃，調(diào)節(jié)pH，葡萄糖添加量2％，于121℃下高壓滅菌15min，得到牡蠣發(fā)酵培養(yǎng)基。

（3）單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

本試驗將固定料液比1:4(g／mL)、發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％，純化后冷藏菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中活化，調(diào)配至菌懸液濃度為10⁷cfu／mL。分別以發(fā)酵pH、接種量和發(fā)酵時間為變量，進行單因素試驗，每組試驗采取三個平行和一組空白對照，其中發(fā)酵pH為5、6、7、8、9；接種量為2％、4％、6％、8％、10％；發(fā)酵時間為12h、24h、36h、48h、60h?？瞻讓φ战M為發(fā)酵pH7、接種量O％、發(fā)酵時間12h、24h、36h、48h、60h各一個。以發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量為測定指標，研究三個因素對牡蠣發(fā)酵效果的影響，對發(fā)酵工藝進行初步優(yōu)化。

（4）正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

在進行單因素試驗和分析數(shù)據(jù)結(jié)果后，選擇適宜的發(fā)酵pH條件范圍、接種量和發(fā)酵時間，以及空白對照組進行三因素三水平L₉(3⁴)正交優(yōu)化試驗。

（5）蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。具體操作流程如下：

（6）氨基態(tài)氮含量的測定

參照國標GB18186-2000《釀造醬油》規(guī)定采用甲醛電位滴定法測定氨基態(tài)氮含量。具體操作流程如下：

二、結(jié)果與分析

1、單因素試驗結(jié)果

如圖1所示，在發(fā)酵時間和接種量一定的基礎上，當牡蠣培養(yǎng)基的pH為5～7時，氨基態(tài)氮的含量呈上升趨勢，在pH為7時氨基態(tài)氮的含量達到了最高值，pH為7～8時氨基態(tài)氮含量稍有下降，pH為8～9時下降較為明顯，這可能是因為納豆芽孢桿菌生長的最適pH為7，而且納豆激酶在pH為7時納豆激酶活力最高。蛋白質(zhì)含量在pH為5～7時呈下降趨勢，從pH7～9則呈上升趨勢?？赡芘c納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶活力下降有關(guān)。

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