為建立一種以水合茚三酮為顯色劑準(zhǔn)確定量檢測(cè)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)的方法，本文系統(tǒng)研究了顯色酸度、顯色劑用量、加熱溫度和時(shí)間等顯色條件對(duì)水合茚三酮與GABA顯色反應(yīng)的影響，并在最優(yōu)條件下對(duì)該方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在pH=7.0時(shí)，GABA與1.8 g·L^-1茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min后顯色穩(wěn)定。顯色后在567 nm處的吸光度與GABA的濃度線(xiàn)性關(guān)系良好(y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983)。該方法重現(xiàn)性好(RSD=0.06%)，準(zhǔn)確度較高(加標(biāo)回收率為95.4%～117.6%)，檢出限達(dá)21.6μg·L^-1，對(duì)GABA有一定的選擇性。對(duì)食品添加劑中的GABA用薄層色譜分離后進(jìn)行顯色測(cè)定，結(jié)果滿(mǎn)意。

近年來(lái)，隨著孤獨(dú)癥、抑郁癥、精神分裂癥等精神類(lèi)疾病對(duì)生命健康和幸福指數(shù)的威脅逐漸增長(zhǎng)，有關(guān)精神類(lèi)疾病的預(yù)防、診療和致病機(jī)理的研究受到日益廣泛的關(guān)注。精神類(lèi)疾病致病原因復(fù)雜，但大多數(shù)中樞神經(jīng)類(lèi)疾病都與神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化相關(guān)。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的抑制類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，主要存在于大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、基底神經(jīng)節(jié)和小腦中，介導(dǎo)了40%以上的中樞神經(jīng)抑制性信號(hào)。GABA作為一種重要的藥食同源的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有延緩大腦衰老、降低血壓、增強(qiáng)免疫力、活化肝腎、增強(qiáng)記憶力和抗焦慮等功效。研究表明GABA對(duì)抑郁癥、孤獨(dú)癥、精神分裂癥、腦血管病引起的偏癱、記憶障礙、兒童智力發(fā)育遲緩等多種疾病均有不同程度的療效，具有很好的應(yīng)用前景。目前市場(chǎng)上已出現(xiàn)多種添加或號(hào)稱(chēng)富含GABA的保健食品和藥品。因此，發(fā)展一種簡(jiǎn)便快捷的測(cè)量方法準(zhǔn)確測(cè)定GABA含量具有重要意義。

目前GABA的定量分析常用(超)高效液相色譜法、電泳法和紙層析法、氨基酸自動(dòng)分析儀法等。因GABA自身在可見(jiàn)區(qū)和近紫外區(qū)都無(wú)明顯吸收，測(cè)定時(shí)多是基于GABA與其他試劑反應(yīng)生成的衍生物的光吸收進(jìn)行測(cè)定。常用衍生化試劑主要有苯二醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯以及鄰苯二甲醛和水合茚三酮等。其中水合茚三酮因反應(yīng)產(chǎn)物顏色明顯，在可見(jiàn)區(qū)即可測(cè)定，對(duì)儀器的要求低，應(yīng)用較廣。雖已有關(guān)于水合茚三酮顯色法測(cè)定氨基酸的報(bào)道，但不同文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定條件不盡相同，且水合茚三酮與結(jié)構(gòu)不同的氨基酸的顯色反應(yīng)也存在差異。因此本文針對(duì)GABA，研究了各種因素對(duì)其與水合茚三酮顯色反應(yīng)的影響，確定了最佳測(cè)定條件，并考察了該方法的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度、選擇性等分析性能，并結(jié)合薄層色譜實(shí)現(xiàn)了食品添加劑中GABA的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

PH-10/100 酸度計(jì)(上海越平科學(xué)儀器);PE Lambda 35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Perkin-Elmer Co.，Wellesley， MA， USA);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器);FA 1204C型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器)。

GABA(批號(hào)：H1829037)，購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司；水合茚三酮(批號(hào)：20200507)、乙醇(批號(hào)：20200612)、磷酸(批號(hào)：20190715)、可溶性淀粉、聚乙二醇、二氧化鈰、氯化亞錫、Fe2(SO4)3·xH2O、FeCl2·4H2O、Na2SO4，以上試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。玉米淀粉發(fā)酵提取的含GABA的食品添加劑，購(gòu)自浙江益萬(wàn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最佳測(cè)量波長(zhǎng)的選擇

在10 mL比色管中加入2 mL 64 g·L^-1 GABA(或水)、2 mL 0.3 mol·L^-1 pH=5.0的磷酸緩沖溶液和1 mL 3.2 g·L^-1的水合茚三酮溶液(用水或乙醇溶解)，混合均勻后，沸水浴20 min， 冷卻至室溫后，用水定容至5 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)其吸收光譜，比較水溶和醇溶的區(qū)別，并確定適宜的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2 顯色條件的影響和選擇

本文采用單變量比較法分別研究酸度、顯色劑用量、顯色溫度和加熱時(shí)間對(duì)顯色測(cè)定的影響。具體來(lái)說(shuō)，在10 mL比色管中依次加入1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液、1 mL不同pH的磷酸緩沖溶液(0.3 mol·L^-1)和2 mL不同濃度的水合茚三酮乙醇溶液，用水定容至5 mL，混勻并水浴加熱一定時(shí)間后，冷卻至室溫，定容至5 mL，混勻后測(cè)其吸收光譜，并比較不同條件下顯色后溶液在選定波長(zhǎng)的吸光度。

1.2.3 茚三酮顯色法測(cè)定GABA的性能評(píng)價(jià)

探究酸度、顯色劑用量、溫度和加熱時(shí)間等因素對(duì)顯色的影響后，在最佳顯色條件下分別對(duì)水合茚三酮顯色測(cè)定GABA的工作曲線(xiàn)、重現(xiàn)性和抗干擾能力等進(jìn)行了考察。

干擾物的選擇主要是樣品中可能存在的共存組分和根據(jù)顯色原理可能會(huì)干擾的一些物質(zhì)。將40 mg·L^-1的GABA溶液及相同濃度GABA但加有不同干擾物的混合液(1.5 g·L^-1淀粉、15 mg·L^-1聚乙二醇、45 mg·L^-1 Fe3+、30 mg·L^-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亞錫和15 mg·L^-1二氧化鈰)分別在最佳條件下顯色測(cè)定，并比較加入干擾物對(duì)溶液吸光度的影響，考察水合茚三酮顯色法測(cè)定GABA的抗干擾能力。

1.2.4 薄層色譜分離與實(shí)際樣品檢測(cè)

為避免實(shí)際樣品中可能存在的其他氨基酸或蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，在進(jìn)行光度測(cè)定前進(jìn)行了薄層色譜分離。薄層色譜條件為：高效硅膠薄層板(50 mm×200 mm， 100℃下活化1 h)，點(diǎn)樣3 μL，展開(kāi)劑為正丁醇、冰乙酸、水混合液(4∶2.2∶1，V/V)，顯色方法：以2%的茚三酮乙醇溶液為顯色劑，噴灑后在烘箱中100℃加熱顯色至斑點(diǎn)清晰。

將薄層色譜分離后的GABA斑點(diǎn)取下溶解，在選定條件下，利用水合茚三酮對(duì)市售食品添加劑中GABA進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)三個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收及與其他氨基酸的分離實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與討論

2.1 水合茚三酮溶劑的選擇與最佳測(cè)量波長(zhǎng)的確定

文獻(xiàn)報(bào)道中，常以水或乙醇為溶劑溶解水合茚三酮作為顯色劑來(lái)檢測(cè)游離氨基酸，故本文首先對(duì)比用水和乙醇分別溶解水合茚三酮對(duì)GABA測(cè)定的區(qū)別。在相同濃度下以對(duì)應(yīng)試劑空白為參比得到的結(jié)果如圖1所示。水溶的水合茚三酮與GABA沸水浴后和水溶的水合茚三酮溶液自身沸水浴后在可見(jiàn)區(qū)內(nèi)均無(wú)明顯吸收峰，而乙醇溶解的水合茚三酮與GABA沸水浴后在420 nm和567 nm有明顯吸收峰，故用乙醇溶解水合茚三酮較好。此外，因在420 nm處的吸收峰與水合茚三酮乙醇溶液自身沸水浴后在357 nm處的吸收峰有重合，為避免干擾，選擇567 nm作為測(cè)量波長(zhǎng)最佳。

2.2 顯色條件的影響

顯色條件對(duì)于GABA定量轉(zhuǎn)化成有色吸光物質(zhì)至關(guān)重要。本文采用單變量比較法分別研究了酸度、顯色劑用量、顯色溫度和加熱顯色時(shí)間對(duì)顯色測(cè)定的影響，具體分別討論如下。

2.2.1 酸度的影響

文獻(xiàn)報(bào)道的茚三酮顯色法測(cè)定氨基酸的酸度條件差別較大，為探究茚三酮顯色測(cè)定GABA的最佳酸度，將1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液和2 mL 1.6 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液，分別在不同pH下沸水浴20 min， 冷卻后，定容混勻并測(cè)567 nm處的吸光度，結(jié)果如圖 2 a所示。在pH=3.0和4.0時(shí)，水合茚三酮乙醇溶液與GABA沸水浴后測(cè)得吸光度幾乎為零，故此酸度不適宜顯色。當(dāng)pH大于4.0時(shí)，水合茚三酮與GABA的顯色反應(yīng)正常進(jìn)行，吸光度隨pH的升高逐漸升高，并在pH=7.0時(shí)達(dá)到峰值，隨后呈明顯下降趨勢(shì)。這說(shuō)明水合茚三酮與GABA的顯色反應(yīng)需在適宜酸度范圍內(nèi)進(jìn)行，pH=7.0為最佳顯色酸度。

2.2.2 顯色劑用量的影響

為探究顯色劑用量的影響，在確定最佳顯色酸度的基礎(chǔ)上(pH=7)將1 mL 64 mg·L^-1 GABA水溶液分別和2 mL不同濃度的水合茚三酮乙醇溶液沸水浴20 min， 冷卻至室溫后定容，測(cè)567 nm處的吸光度。結(jié)果如圖 2 b 所示。在水合茚三酮濃度為0.4～1.6 g·L^-1時(shí)，顯色后吸光度隨水合茚三酮濃度的增加呈明顯增加趨勢(shì)。當(dāng)水合茚三酮濃度在1.6～3.2 g·L^-1時(shí)，吸光度變化較小。本文后續(xù)均采用1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液進(jìn)行顯色。

2.2.3 顯色溫度的影響

加熱可加速反應(yīng)的進(jìn)行，但溫度太高也會(huì)影響試劑的穩(wěn)定性。將1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸緩沖溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮乙醇溶液混勻后定容至5 mL，然后分別在不同溫度下水浴加熱30 min， 冷卻后再用水定容至5 mL搖勻，測(cè)567 nm處的吸光度。結(jié)果(圖2 c)表明：在40～70℃水浴加熱30 min， 吸光度幾乎為0，說(shuō)明水合茚三酮與GABA基本沒(méi)發(fā)生顯色反應(yīng)，無(wú)法測(cè)定；當(dāng)加熱溫度為85℃時(shí)，吸光度增大，水合茚三酮與GABA部分顯色，但反應(yīng)不完全；當(dāng)水浴溫度升高至100℃時(shí)，吸光度急劇增大，水合茚三酮與GABA的顯色反應(yīng)程度顯著增高；溫度繼續(xù)增高會(huì)影響茚三酮的穩(wěn)定性，故確定100℃為最佳顯色溫度。

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