有機(jī)砷制劑是畜禽生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的飼料添加劑，其種類主要有洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸等，具有抗菌、抗球蟲、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、提高飼料利用率、改善產(chǎn)品外觀等作用。長期、大量使用有機(jī)砷制劑可導(dǎo)致過量的砷蓄積在畜禽體內(nèi)，造成器官組織功能紊亂和器質(zhì)性病變，表現(xiàn)為中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，視神經(jīng)萎縮，甚至失明。另外，有機(jī)砷不易被機(jī)體吸收，大部分以原形隨排泄物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，污染水體和土壤，通過食物鏈的蓄積可對(duì)人類健康造成巨大影響。歐盟和美國早已宣布禁止洛克沙胂和阿散酸的使用，我國農(nóng)業(yè)部第2638號(hào)公告規(guī)定，自2019年5月1日起，禁止使用洛克沙胂、阿散酸的原料藥及各種制劑。為了確保飼料及動(dòng)物性食品安全，維護(hù)公共衛(wèi)生和生態(tài)安全，建立飼料中有機(jī)砷的檢測(cè)方法以監(jiān)控其非法添加勢(shì)在必行。

迄今為止，國內(nèi)外對(duì)有機(jī)砷制劑的檢測(cè)主要采用氣相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)有機(jī)砷制劑的報(bào)道很少，未見關(guān)于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中3種有機(jī)砷制劑的報(bào)道。本研究探討建立采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飼料中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙胂的方法。

一、材料與方法

（一）儀器與材料

1. 儀器。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（QTRAP 4500型，AB Sciex公司，美國）；電子天平（0.01mg,METTLER公司，瑞士）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph公司，德國）；高速離心機(jī)（Sigma公司，德國）；渦旋混合儀（IKA公司，德國）。

2. 試劑與藥品。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，J.T.Baker公司）；水為超純水；10%甲醇水溶液；1%甲酸水-乙腈溶液（25∶75,V∶V）：取1.0m L甲酸加入到99 m L 75%乙腈水溶液中；洛克沙胂（含量99.0%）、阿散酸（含量99.0%）和硝苯砷酸（含量99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司，德國）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

精密稱取3種有機(jī)砷制劑對(duì)照品各10 mg，置于3個(gè)100 m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得終濃度為100μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20℃冰箱中保存6個(gè)月，臨用前用10%甲醇水溶液稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2. 樣品處理。

稱取飼料樣品2.00（±0.02) g于50 m L離心管中，加入10 m L 1%甲酸水-乙腈（25∶75,V∶V）超聲提取10 min，中間手動(dòng)振搖2次，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，重復(fù)提取1次，合并上清液，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至<3 m L，用10%甲醇水溶液定容至5 m L,6 000 r/min離心10 min，上清液過0.22μm濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

3. 色譜條件。

色譜柱為phenomenex Kinetex^RF5色譜柱（3.0 mm×50 mm,2.6μm，美國Phenomenex公司）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水；流速為0.4 m L/min；進(jìn)樣量為5μL；柱溫40℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

4．質(zhì)譜條件。

電噴霧離子源；掃描方式為正、負(fù)離子同時(shí)掃描(ESI±）；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）為5 500 V；霧化氣壓力（GS1）為50 psi；氣簾氣壓力（CUR）為30 psi；輔助氣流速（GS2）為60 psi；離子源溫度500℃；碰撞氣（CAD),Medium。離子參數(shù)見表2。

二、結(jié)果與分析

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密量取3種有機(jī)砷制劑標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，添加到空白樣品中，制得阿散酸和洛克沙胂濃度為5.0、10、20、50、100、200μg/kg的各系列空白添加試料；制得硝苯砷酸濃度為50、100、200、500、1000、2000μg/kg的各系列空白添加試料，樣品處理后，上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積y為縱坐標(biāo)，各系列空白添加的濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表3）。

（二）檢出限與定量限

用空白飼料樣品進(jìn)行添加試驗(yàn)，以3倍信噪比（S/N≥3）測(cè)得洛克沙胂、阿散酸的檢出限為5.0μg/kg，硝苯砷酸的檢出限為50.0μg/kg；以10倍信噪比（S/N≥10）測(cè)得阿散酸、洛克沙胂的定量限為10.0μg/kg，硝苯砷酸的定量限為100.0μg/kg?？瞻罪暳咸砑勇蹇松畴?、阿散酸、硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖如圖1所示。

（三）準(zhǔn)確度與精密度

空白飼料樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，阿散酸和洛克沙胂添加濃度為10、20、40μg/kg，硝苯砷酸的添加濃度為100、200、400μg/kg，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品，重復(fù)3次，按照樣品處理方法制備樣品溶液，回收率及精密度見表4和表5。

三、討論

（一）提取溶劑的選擇

有機(jī)砷制劑易溶于甲醇、乙醇、乙腈和熱水中，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，分別比較了甲醇和水、乙腈和水、磷酸氫二鉀作為提取溶液時(shí)的提取效率，結(jié)果表明，提取液中含有大比例水相時(shí)回收率只有20%～30%，提取液中含有大比例有機(jī)相時(shí)回收率明顯升高，而且大比例的乙腈能使樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，可減少雜質(zhì)干擾。比較不同比例的乙腈-水（50∶50、75∶25、90∶10,V∶V），以乙腈-水（75∶25,V∶V）提取回收率最高，而加入0.1%甲酸、0.5%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，經(jīng)過上機(jī)檢測(cè)，采用1%甲酸水-乙腈（25∶75,V∶V）時(shí)，回收率達(dá)到60%～80%，色譜圖良好。

（二）提取方法的選擇

常見的飼料中藥物提取方法有振蕩、渦旋和超聲法，前兩者通常需要較長的時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲處理，將提取程序所需時(shí)間縮短到10 min，且能得到滿意的回收率。

（三）分離條件的優(yōu)化

通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成、梯度、p H值、選擇適宜的色譜柱來獲得最佳的色譜分離條件。選用waters BEH C₁₈柱時(shí)，各化合物不能達(dá)到基線分離，本研究選用phenomenex Kinetex^R F5色譜柱，各目標(biāo)化合物的分離度良好；在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸獲得了更加穩(wěn)定和對(duì)稱的峰形。

四、結(jié)論

本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)飼料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，操作簡單，色譜條件易掌握且重復(fù)性好。洛克沙胂和阿散酸的平均加標(biāo)回收率在62.7%～81.7%,RSD≤15%；硝苯砷酸的平均加標(biāo)回收率為72.5%～83.3%,RSD≤15%，方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度都能滿足分析要求，對(duì)測(cè)定飼料中的有機(jī)砷制劑有很好的適用性。

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