甜葉菊是原產(chǎn)于南美洲的一種菊科草本植物。自20世紀(jì)70年代引進(jìn)以來，中國成為全球最大的甜葉菊種植產(chǎn)地之一。甜葉菊富含甜菊苷、萊鮑迪甙A等甜菊糖苷，目前作為一種經(jīng)濟(jì)作物。主要制成甜味劑，在食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用圈。甜葉菊除含有甜菊糖苷外，還含有豐富的酚酸、黃酮等多種具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和降血脂等作用的活性物質(zhì)剛。在甜菊糖苷生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量甜葉菊廢渣。這些廢渣主要處理方式是焚燒和堆肥，其中的酚酸、黃酮等生物活性成分沒有得到高效、合理地利用，反而對環(huán)境產(chǎn)生污染染。

Zhao等同通過研究甜葉菊廢渣提取物發(fā)現(xiàn)。甜葉菊廢渣提取物含有綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A(3，5-二咖啡酰奎寧酸)、異綠原酸B(3，4-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C(4，5-二咖啡?？鼘幩?、槲皮苷、槲皮素等生物活性成分，具有較強(qiáng)的自由基清除能力，并有明顯的抗炎作用。其中，異綠原酸A和異綠原酸C是甜葉菊廢渣提取物的主要成分。付曉等同使用HPLC法分析甜葉菊綠原酸類成分，其中主要為異綠原酸A、異綠原酸C以及相對低含量的綠原酸。異綠原酸是綠原酸的二咖啡?；〈悩?gòu)體，在植物中廣泛存在，主要存在忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬植物中，其中包括金銀花、杜仲。綠原酸類化合物具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎等生物活性。本課題組在近年的研究中證實(shí)甜葉菊廢渣提取物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎作用，然而尚未確定其中發(fā)揮主要功能活性的物質(zhì)。異綠原酸作為甜葉菊廢渣提取物的主要成分，是否是其主要的抗炎活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。異綠原酸A與異綠原酸C分子式相同。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，兩者在功能活性上可能存在差異。目前對于甜葉菊廢渣提取物及其主要成分異綠原酸A和異綠原酸C的抗炎作用還鮮見報(bào)道。隨著研究方法和科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對甜葉菊的研究開發(fā)和綜合利用將不斷深入。

為研究甜葉菊廢渣提取物及其主要成分異綠原酸的抗炎作用，本文通過建立RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，初步評價(jià)甜葉菊廢渣提取物及其主要成分異綠原酸的體外抗炎作用。通過建立角叉菜膠致小鼠足腫脹急性炎癥模型，通過測定小鼠足趾的腫脹程度，以及小鼠血清和肝臟中NO、SOD、MDA和PGE2水平，驗(yàn)證甜葉菊廢渣提取物及其主要成分異綠原酸的體內(nèi)抗炎效果，為開發(fā)甜葉菊廢渣的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甜葉菊廢渣提取物(主要成分：綠原酸4.65％。隱綠原酸2.78％，咖啡酸9.72％，異綠原酸A4.14％，異綠原酸B3.28％，異綠原酸C12.67％，槲皮苷1.88％，槲皮素0.71％)、甜葉菊異綠原酸A和異綠原酸C(＞90％)，河北晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司：地塞米松，MYM生物技術(shù)有限公司；N0、S0D、MDA試劑盒，南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒、角叉菜膠、脂多糖(LPS)、DMEM高糖無酚紅培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；PGE2試劑盒，北京方程生物科技有限公司；阿司匹林，沈陽奧吉那藥業(yè)有限公司；RAW264.7細(xì)胞(ATCCNo.TIB-71)，國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；噻唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma試劑公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SpectmMaxl3連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美國MolecularDevices公司；601-06游標(biāo)卡尺，哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限公司：TGl78型微量離心機(jī)，德國HERMLE公司；Axiovert200型倒置顯微鏡，德國Zeiss公司：TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海智城分析儀器制造有限公司：HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科興儀器廠；GalaxvS型C0₂培養(yǎng)箱，英國RSBiotech公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級ICR雄性小鼠(6～8周齡)，許可證號為SCXK(京)2012-0001，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)期問，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度為(21±2)℃，相對濕度(40±5)％，晝夜明暗交替時(shí)問12h/12h環(huán)境。動(dòng)物自由采食和飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甜葉菊廢渣提取物及其主要成分異綠原酸

對RAW264.7細(xì)胞存活率和N0生成量的影響接種細(xì)胞密度為5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液于96孔平板中，將平板放入37℃，5％C0₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸棄上清，加入混合有樣品的DMEM完全培養(yǎng)液，使樣品的終質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，l，2mg/mL。陽性對照組每孔加入LPS(20μg/mL)。試驗(yàn)孔被分為LPS與異綠原酸A、異綠原酸C、甜葉菊廢渣提取物共同作用組和異綠原酸A、異綠原酸C、甜葉菊廢渣提取物單獨(dú)添加組2種，于37℃、5％C0₂飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后收集上清液，選用N0試劑盒測定N0生成量。選用MTT試劑盒測定各組細(xì)胞存活率。

1.2.2 動(dòng)物分組給藥

藥ICR雄性小鼠(6～8周齡)110只，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，正常喂食喂水，適應(yīng)期后隨機(jī)分為對照組、地塞米松組(10mg/kgbw)、阿斯匹林組(10mg/kgbw)、甜葉菊廢渣提取物、異綠原酸A和異綠原酸C組，其中樣品組分為低劑量(0.5mg/kgbw)、中劑量組(1.0g/kgw)、高劑量組(2.0kg/kgbw)。連續(xù)給藥7d，每日灌喂藥品1次，每3d稱量小鼠體重，并根據(jù)小鼠體重變化情況調(diào)節(jié)給藥劑量。

1.2.3 角叉菜膠致小鼠足趾腫脹的測定

按照1.2.2節(jié)對小鼠分組給藥，末次給藥30min后，給每只小鼠左側(cè)足趾皮下注射25μL1％角叉菜膠，右側(cè)足趾不作處理。4h后分別用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量每只小鼠2只足趾的厚度，以左、右后肢足趾厚度之差表示炎癥腫脹度。計(jì)算各組腫脹度值及腫脹抑制率。

1.2.4 小鼠血清中N0、S0D、MDA和PGE2的測定

成足趾腫脹度測量后，摘取所有小鼠的眼球，取其血液于2mL離心管中。置37℃水浴中促其凝固。然后4℃，3000r/min離心10min，得到上清液即血清。依照試劑盒說明書測定小鼠血清中S0D、MDA、N0和PGE2含量，于24h內(nèi)完成全部測定，保證數(shù)據(jù)的可靠性。

1.2.5 小鼠肝臟中N0、S0D、MDA和PGE2的測定

將處死的小鼠解剖，取肝臟用4℃預(yù)冷的生理鹽水洗去血液，濾紙拭干后置于離心管內(nèi)，放入液氮速凍，待全部解剖完成后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保藏，備用。取相同部位肝臟0.1mg于勻漿管中，加入0.9mL預(yù)冷的生理鹽水。用組織搗碎機(jī)10000r/min上、下研磨，每次10s，間隔30s，連續(xù)5次，制成10％肝勻漿。將制備好的勻漿液在4℃，3500r/min條件下離心15min，吸取上清液，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ勒赵噭┖姓f明書測定小鼠肝臟勻漿中蛋白、S0D、MDA、N0和PGE2含量，于24h內(nèi)完成全部測定，保證數(shù)據(jù)的可靠性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析(0ne-wavANOVA)，多重比較采用Duncan法，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著性差異。

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