2 結(jié)果與分析

2.1 微顆粒對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的作用

從圖1中可以看出，與對(duì)照組相比。添加微顆粒對(duì)阿魏酸酯酶的酶活產(chǎn)生一定的影響。這種影響與微顆粒的種類(lèi)、添加微顆粒的質(zhì)量濃度以及發(fā)酵時(shí)間都有關(guān)。由圖1a和1b可知，發(fā)酵第3天，添加微顆粒組的阿魏酸酯酶的酶活均高于對(duì)照組；發(fā)酵第5天，當(dāng)滑石粉和氧化鋁質(zhì)量濃度的增大到一定程度時(shí)(滑石粉＞5g/L，氧化鋁＞1g/L)，阿魏酸酯酶的酶活受到抑制：發(fā)酵第7天，高質(zhì)量濃度的滑石粉和氧化鋁對(duì)阿魏酸酯酶活性的抑制情況有所改善。由圖1c可以看出，高嶺土的添加會(huì)提高黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活。綜上，添加高嶺土對(duì)黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳。整體來(lái)看，3種微顆粒均是在發(fā)酵第5天、質(zhì)量濃度為0.5g/L時(shí)，阿魏酸酯酶酶活最高。

2.2 微顆粒對(duì)液體深層發(fā)酵中黑曲霉生物量、菌團(tuán)大小以及形態(tài)的影響

為揭示添加氧化鋁、滑石粉和高嶺土對(duì)液體深層發(fā)酵中黑曲霉生長(zhǎng)的影響，比較了發(fā)酵第5天時(shí)的黑曲霉生物量。從圖2可以看出，高嶺土對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有負(fù)面作用，而高嶺土對(duì)黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳(圖1)，表明細(xì)胞的積累可能與阿魏酸酯酶酶活的提高無(wú)關(guān)。0.5g/L滑石粉有利于菌絲生長(zhǎng)，然而隨著培養(yǎng)基中滑石粉質(zhì)量濃度的增加.菌絲生長(zhǎng)減慢，表明少量添加滑石粉可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，過(guò)量添加滑石粉會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)。
 

由圖3可知，添加微顆粒后菌團(tuán)直徑均小于對(duì)照組(2.2mm)，并且添加微顆粒的質(zhì)量濃度越大，菌團(tuán)直徑越小。除改變菌團(tuán)大小外，添加微顆粒還會(huì)改變真菌菌絲的結(jié)構(gòu)。由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，添加微顆粒后菌絲體比較松散，菌絲不完整。其中，添加0.5g/L高嶺土對(duì)菌絲體表面結(jié)構(gòu)的影響最大。微顆粒影響真菌菌絲形態(tài)可能有2個(gè)方面的原因：一是懸浮的微顆粒在菌團(tuán)開(kāi)始形成時(shí)阻止了菌絲的聚集，二是菌團(tuán)形成后搖瓶培養(yǎng)使微顆粒與菌團(tuán)之間相互碰撞、剪切造成菌團(tuán)被破壞。整體來(lái)看，3種顆粒中，高嶺土對(duì)菌團(tuán)大小和菌絲結(jié)構(gòu)的影響最大，這可能與高嶺土的結(jié)構(gòu)有關(guān)。由圖5可以看出氧化鋁顆粒一般是網(wǎng)形的，高嶺土顆粒一般呈尖銳的不規(guī)則形狀，而滑石粉顆粒的形狀則介于兩者之問(wèn)。相比于光滑的、規(guī)則的氧化鋁顆粒，尖銳的不規(guī)則形狀的高嶺土顆粒對(duì)菌絲聚集產(chǎn)生的破壞作用更大。

3 討論

絲狀真菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。在深層培養(yǎng)過(guò)程中，它們表現(xiàn)出與產(chǎn)量相關(guān)的復(fù)雜的形態(tài)學(xué)周期(從稠密的球形顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌木z)，這對(duì)培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)化非常有利。碳源的類(lèi)型和濃度以及氮源、磷酸鹽、微量元素，溶解氧和二氧化碳、pH值和溫度等因素都影響著真菌的形態(tài)；另外培養(yǎng)容器或者生物反應(yīng)器的幾何學(xué)、攪拌系統(tǒng)、流變學(xué)以及培養(yǎng)基的類(lèi)型都調(diào)節(jié)著培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶會(huì)受到3種微顆粒的影響，添加微顆粒的不同對(duì)酶活的影響也不同，其中高嶺土對(duì)黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最為顯著。在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)問(wèn)和適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度下，氧化鋁和滑石粉也有利于提高黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活。然而，添加微顆粒對(duì)真菌菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生了負(fù)面影響。微顆粒對(duì)真菌細(xì)胞積累的影響與對(duì)酶活的影響產(chǎn)生了相反的效果，說(shuō)明了黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高不是單純的黑曲霉細(xì)胞積累的作用。先前的研究也顯示了微顆粒似乎能提高酶的活力、增加酶的產(chǎn)量，卻使生物量不變或減少。這些都表明微顆粒對(duì)真菌細(xì)胞的作用不是一般的代謝調(diào)控刺激，而是真菌細(xì)胞在微顆粒存在下發(fā)生了一系列細(xì)胞生理學(xué)方面的復(fù)雜變化。

絲狀真菌的特殊形態(tài)使它特別容易形成菌團(tuán)，菌團(tuán)逐漸變大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足。添加微顆粒后，菌團(tuán)的平均粒徑顯著減小，氧氣的傳遞就更加充分，有利于特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，這可能是添加微顆粒后黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活提高的原因。在3種微顆粒中，高嶺土對(duì)菌團(tuán)平均粒徑的影響最為顯著，并且高嶺土對(duì)黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果也最為顯著，因此黑曲霉菌團(tuán)大小與黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活大小可能存在一定關(guān)系。本研究選用了3種顆粒大小和形態(tài)不同的微顆粒進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)黑曲霉菌絲形態(tài)的影響存在差異，因此可以通過(guò)改變微顆粒的大小和濃度精確地調(diào)整絲狀微生物的形態(tài)。微顆粒的微觀研究進(jìn)一步證實(shí)微顆粒對(duì)菌絲的影響主要是通過(guò)調(diào)節(jié)菌絲形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有研究已經(jīng)證明，向培養(yǎng)基中添加滑石粉和氧化鋁強(qiáng)烈地影響了黑曲霉和其它絲狀微生物的形態(tài)。絲狀微生物形態(tài)的改變對(duì)其產(chǎn)代謝物也有一定的影響。在搖瓶發(fā)酵的黑曲霉小菌落中，不同部位基因表達(dá)水平是不一樣的，mRNA的積累也存在著差異。小菌落的外圍的每個(gè)菌絲中RNA的含量大約是中心的45倍，這種差異對(duì)代謝酶的合成也有一定的影響。故微顆粒也可能通過(guò)改變黑曲霉的菌絲形態(tài)影響合成阿魏酸酯酶基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究探究3種微顆粒在黑曲霉深層發(fā)酵過(guò)程中對(duì)絲狀真菌細(xì)胞形態(tài)和菌株產(chǎn)酶酶活的影響。研究發(fā)現(xiàn)，表面尖銳并呈不規(guī)則狀的高嶺土顆粒對(duì)黑曲霉菌絲形態(tài)的影響最大。同時(shí)對(duì)黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高也最大，說(shuō)明真菌產(chǎn)酶的酶活大小可能受到絲狀真菌形態(tài)的影響。因此，無(wú)論在研究還是工業(yè)應(yīng)用上，若要增大菌株產(chǎn)酶的活力或者產(chǎn)量，可以通過(guò)添加微顆?？刂凭z形態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種添加微顆粒改變菌絲形態(tài)的方法為更好地探究絲狀真菌代謝能力提供了一條有效途徑。

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