阿魏酸酯酶是一種能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵。使阿魏酸游離出來的羧酸酯酶，在食品和飼料等工業(yè)中有著光明的前景。食品工業(yè)利用阿魏酸酯酶降解植物細(xì)胞壁中阿魏酸酯鍵，得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸。通過阿魏酸酯酶的處理。飼料工業(yè)中植物性原材料的細(xì)胞壁變的疏松，更容易被禽畜消化利用。研究表明，真菌和細(xì)菌都能分泌阿魏酸酯酶嘲，然而目前研究較多的是真菌中的黑曲霉。

黑曲霉在工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。如在檸檬酸生產(chǎn)以及各種高價(jià)值酶產(chǎn)品包括果膠酶、蛋白酶、淀粉葡糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶和脂肪酶等的生產(chǎn)。雖然曲霉菌是一種重要的工業(yè)微生物，但這些絲狀微生物中有一個(gè)難以控制的特性就是它復(fù)雜的形態(tài)，它們不僅有致密的小球還有黏性的菌絲網(wǎng)。由于以分散菌絲形態(tài)存在的真菌可以帶來更高的產(chǎn)品收益率。因此其價(jià)值一般優(yōu)于菌絲形成小球形態(tài)的真菌。合適的菌株形態(tài)對(duì)發(fā)酵的重大作用促使研究者嘗試改變真菌的生長特性，相關(guān)研究包括一些培養(yǎng)參數(shù)的改變，如接種量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基配料以及酸堿度。已有研究通過對(duì)具有合適形態(tài)突變體的隨機(jī)篩選得到了較理想的菌團(tuán)形態(tài)，并改善了半纖維素酶的產(chǎn)量。因而，改善真菌形態(tài)已經(jīng)成為生物技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。最近發(fā)現(xiàn)通過向培養(yǎng)基中添加滑石粉和氧化鋁可以控制真菌的形態(tài)，其對(duì)黑曲霉和其它絲狀微生物的形態(tài)發(fā)展具有強(qiáng)烈的影響。本文通過向黑曲霉ZJUQH液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的滑石粉、氧化鋁和高嶺土，探究添加微顆粒對(duì)黑曲霉菌絲生長和產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基配方

1)菌株

黑曲霉ZJUQH，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2)斜面培養(yǎng)基

20％馬鈴薯煮出液，1％葡萄糖。

3)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

2.6％豆粕浸出液、1.035％蛋白胨、0.3％KH₂P0₄、0.8％Na₂HP0₄·7H₂0、0.01％NaC1、0.02％MgS0₄·7H₂0、0.005％CaCl₂，自然pH值。

1.2 主要材料與試劑

滑石粉顆粒(800目)，上海麥克林生化科技有限公司；三氧化二鋁顆粒(200～300目)、高嶺土顆粒(300目)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；馬鈴薯，購于超市；豆粕、蛋白胨，生工生物工程股份有限公司；KH₂P0₄、Na₂HP0₄·7H₂0、NaCl、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿魏酸甲酯，南通飛宇生物科技有限公司；二甲基甲酰胺、色譜純級(jí)乙腈、甲酸、甲醇，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

LC-2010AHT高效液相色譜儀，日本島津公司；Beckman冷凍高速離心機(jī)，美國Beckman公司；L500臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，湖南湘儀有限公司；DCQF-1超聲復(fù)頻清洗器，上海東大超聲儀器有限公司；HYG-Ⅱa恒溫調(diào)速搖床，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司：Stemi2000-C立體顯微鏡，德國ZEISS公司；XL-30ESEM掃描電鏡，荷蘭Philips公司；HitachiS-3000N掃描電鏡，日本Hi-tachi公司；Mastersizer2000激光粒度儀，英國MalvemInstmments公司。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)及酶液制備

將微顆粒的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0.1，0.5，1，5，10，20g/L，即在30mL的培養(yǎng)基中分別加入0.003，0.015，0.03，0.15，0.3，0.6，3g的微顆粒。微顆粒與液體培養(yǎng)基分開滅菌，備用。

菌株接種到配好的PDA培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后制成孢子懸浮液，按一定接種量(孢子數(shù)約107CFU/mL)接種于裝有30mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于28℃，180r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)7d。分別于3，5，7d取樣。將菌懸液置于低速離心機(jī)中3000r/min離心30min，取上清液即為粗酶液于4℃冰箱中保存，待用。

1.5 酶活測(cè)定

1.5.1 阿魏酸酯酶酶活測(cè)定

用一級(jí)色譜純甲醇溶解阿魏酸甲酯配制成50mmol/L的阿魏酸甲酯溶液，再用檸檬酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH6.0)稀釋10倍。取2mL稀釋后的阿魏酸甲酯溶液重新加熱至40℃，加入1mL稀釋10倍的粗酶液?；靹?。混合物于40℃反應(yīng)30min后加熱至100℃，10min后終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物于室溫冷卻，以蒸餾水代替底物溶液體系為空白對(duì)照。

酶解反應(yīng)后的阿魏酸產(chǎn)物參考文獻(xiàn)的HPLC法定量分析，并稍作修改。高效液相色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-0.5％甲酸混合液(V_乙腈：V_0.5％甲酸=30:70)，C18反相柱(250mm×4.6mm，4μm)，檢測(cè)溫度30℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長317nm。阿魏酸酯酶的酶活定義為在40℃，pH6.0條件下，每分鐘水解底物阿魏酸甲酯產(chǎn)生1μmol阿魏酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5.2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)制品配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋成100，50，10，8，4，2，1mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5.1節(jié)中的色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用Bradford的蛋白質(zhì)定量試劑盒法檢測(cè)發(fā)酵上清液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。取考馬斯亮藍(lán)染液平衡至室溫混勻，預(yù)熱分光光度計(jì)。將0，1，2，3，4，5，6μL牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/mL)分別加入酶標(biāo)板，加PBS補(bǔ)足到10μL；加Bradfbrd考馬斯亮藍(lán)染液190μL后混勻，室溫放置5-10min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長595nm處的吸光度值，以不含BSA的樣品吸光度值作為空白對(duì)照，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣品測(cè)定中，取10μL發(fā)酵液樣品和190μL考馬斯亮藍(lán)染液混勻，室溫放置5～10min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長595nm處的吸光度值。隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，用于阿魏酸酯酶比活力的計(jì)算。

1.7 生物量的測(cè)定

將各菌株的發(fā)酵液置于離心杯中，于3000r/min離心30min，收集菌絲沉淀，用與發(fā)酵液體積相等的蒸餾水洗滌并離心，重復(fù)3次，最后將所得菌絲體于60℃烘干至恒重。對(duì)應(yīng)減去微顆粒的質(zhì)量，即得生物量。

1.8 顯微鏡觀察及粒度分布

1)菌體微觀形態(tài)觀察

用立體顯微鏡觀察菌團(tuán)，然后通過預(yù)處理，用XL-30ESEM掃描電鏡對(duì)菌團(tuán)進(jìn)行更細(xì)致的觀察。

2)菌體粒度分析

用HitachiS-3000N掃描電鏡在20kV下觀察微顆粒，然后用Mastersizer2000激光粒度儀測(cè)定樣品的粒度分布。

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