聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類由羥基脂肪酸單體通過酯化聚合得到的高分子化合物，因具有傳統(tǒng)石油基塑料類似的力學(xué)特征、100%生物降解性和生物相容性而被認(rèn)為是最有潛力的綠色環(huán)保材料之一。受限于其高昂的生產(chǎn)成本，PHAs作為綠色環(huán)保材料的應(yīng)用推廣困難。文中分別從細(xì)胞形態(tài)調(diào)控、代謝途徑構(gòu)建、廉價碳源利用和開放式發(fā)酵技術(shù)開發(fā)等方面詳細(xì)介紹了目前有效降低PHAs生產(chǎn)成本的方法。盡管大部分研究成果還局限于實(shí)驗(yàn)室階段，但是研究方法和方向?yàn)閷?shí)現(xiàn)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)。

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類由羥基脂肪酸單體通過酯化聚合得到的高分子化合物，是微生物在特定環(huán)境下的能量儲備物質(zhì)。隨著白色污染加重和石油資源枯竭，具有傳統(tǒng)石油基塑料相似的力學(xué)特征、100%生物降解性和生物相容性的PHAs被認(rèn)為是最有前景的綠色環(huán)保材料之一。目前只有少數(shù)工廠，例如德國Biomer Inc.、美國P&G、巴西PHB Industrial和中國Tianan Biologic等實(shí)現(xiàn)了PHAs的中試級別生產(chǎn)，但產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場需求。主要原因是PHAs高昂的生產(chǎn)成本(2.2–5.0歐元/kg)大大限制了其作為綠色環(huán)保材料的應(yīng)用。本文首先介紹了PHAs的類型和合成代謝途徑，隨后從細(xì)胞形態(tài)調(diào)控、代謝途徑構(gòu)建、廉價碳源利用和開放式發(fā)酵技術(shù)開發(fā)等方面詳細(xì)介紹了不同研究團(tuán)隊(duì)在降低PHAs生產(chǎn)成本方面的研究成果，以期為實(shí)現(xiàn)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 PHAs簡介

1.1 PHAs分類

根據(jù)單體碳原子數(shù)PHAs可以分為短鏈PHAs(Short-chain-length，SCL)和中長鏈PHAs (Mediumlong-chain-length，MCL)，根據(jù)單體不同排列方式又可以分為均聚物(Homo polymer)、無規(guī)共聚物(Random copolymer)和嵌段共聚物(Block copolymer)。超過150種羥基脂肪酸可以作為PHAs合成的單體，其多元化組合賦予了PHAs性能的多樣性，例如SCL PHAs材料堅(jiān)硬易碎，MCL PHAs材料韌性良好，按照不同比例混合后的共聚物表現(xiàn)出不同的硬度和韌性，這為開發(fā)不同特性的產(chǎn)品提供了無限可能。

第一代商業(yè)PHAs，聚-3羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是3-羥基丁酸(3HB)的均聚物，也是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的PHAs材料。因?yàn)槠淞己玫目寡趸?、防水性和較高的硬度，PHB材料主要被開發(fā)用作包裝材料。但是它較脆的材質(zhì)和接近降解溫度(220℃)的熔解溫度(175℃)不利于熱加工處理。第二代商業(yè)PHAs是由3HB和3-羥基戊酸(3HV)無規(guī)則共聚而成的聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，P(3HB-co-3HV))。

相比于PHB，P(3HB-co-3HV)在熱加工性能、韌性和延展性方面均得到了提高。第三代商業(yè)PHAs是由3HB和中鏈3-羥基己酸(3HHx)無規(guī)則共聚合成的聚-3-羥基丁酸-3-羥基己酸(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，P(3HB-co-3HHx))。3HHx的混入給予了材料優(yōu)異的彈性體性能和生物相容性能，因而被開發(fā)用作生物醫(yī)用材料。隨著PHAs研究的進(jìn)一步發(fā)展，研究人員預(yù)測P(3HB-co-4HB)將會成為第四代商業(yè)PHAs，4HB的混入成功克服了PHB質(zhì)地脆弱的缺點(diǎn)。目前PHAs已經(jīng)用于塑料工業(yè)的包裝材料、農(nóng)業(yè)的農(nóng)膜材料以及醫(yī)藥領(lǐng)域的組織工程和藥物緩釋材料等的加工生產(chǎn)中。

1.2 PHAs合成代謝途徑

超過90個屬的500種細(xì)菌具有PHAs合成能力，其中PHAs合成代謝途徑主要有3條(圖1，紅色部分)。途徑Ⅰ：從糖酵解途徑(EMP)生成的兩分子乙酰Co A (Acetyl-Co A)依次經(jīng)β-酮基硫解酶(Pha A)和乙酰乙酰Co A還原酶(Pha B)，最后在PHA合酶(Pha C)催化下合成PHB。途徑Ⅱ：同樣以乙酰Co A為起點(diǎn)的脂肪酸從頭合成途徑(de novo synthesis)的中間產(chǎn)物參與PHAs的合成。該途徑的關(guān)鍵酶3-羥基酯酰ACP-Co A轉(zhuǎn)移酶(Pha G)將R-3-羥基酯酰ACP (R-3-hydroxyacylACP)轉(zhuǎn)化為R-3-羥基酯酰Co A (R-3-hydroxyacylCo A)，從而被Pha C催化合成PHAs。途徑Ⅲ：脂肪酸被活化成酯酰Co A后進(jìn)入β-氧化(β-oxidation)途徑，中間產(chǎn)物S-3-羥基酯酰Co A(S-3-hydroxyacyl-Co A)在差向異構(gòu)酶作用下轉(zhuǎn)換成可以被Pha C催化利用的R-3-羥基酯酰Co A。盡管部分微生物利用脂肪酸合成PHB，但是其主要利用β-氧化途徑生成的乙酰Co A通過途徑Ⅰ合成。

除這3條主要途徑外，微生物體內(nèi)還存在其他PHAs合成途徑，以及通過基因工程構(gòu)建的新的PHAs合成途徑(圖1，藍(lán)色部分)。例如從草酰乙酸(Oxaloacetate)出發(fā)，通過基因工程手段為P(3HB-co-3HV)的合成提供3-羥基戊酰Co A (3-hydroxyvaleryl-Co A，3HV)；從琥珀酰Co A (Succinyl-Co A)出發(fā)為P(3HB-co-4HB)合成提供4-羥基丁酰Co A (4-hydroxybutyryl-Co A，4HB)等。

2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)低成本PHAs

PHAs的生產(chǎn)成本集中在發(fā)酵物料的消耗和滅菌過程的能源消耗上，其中前者占成本的50%，后者占30%?；诖耍鱾€研究團(tuán)隊(duì)希望通過降低發(fā)酵物料成本和滅菌過程能源消耗成本來降低PHAs的生產(chǎn)成本。例如提高菌株產(chǎn)率、利用廉價物料以及開發(fā)開放式發(fā)酵技術(shù)等。

2.1 細(xì)胞形態(tài)調(diào)控及代謝途徑構(gòu)建

作為胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，當(dāng)鹽單胞菌Halomonas campaniensis LS21內(nèi)PHAs充滿細(xì)胞體積時也僅達(dá)到生物量的60%，這表明PHAs積累量嚴(yán)重受限于細(xì)胞體積。研究人員發(fā)現(xiàn)通過抑制細(xì)胞分裂蛋白Fts Z，由桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀形態(tài)的重組大腸桿菌E.coli Trans1T1的PHB占比增加了125%。隨后，Wu等發(fā)現(xiàn)基因min CD和細(xì)胞骨架蛋白Mer B也具有抑制細(xì)胞分裂和調(diào)控細(xì)胞形態(tài)的作用，重組大腸桿菌E.coli JM109內(nèi)的PHB積累量達(dá)到生物量的80%。基因min CD和fts Z在PHAs生產(chǎn)菌株中同樣具有影響細(xì)胞分裂和形態(tài)的作用。過表達(dá)min CD的重組鹽單胞菌Halomonas TD08在靜置培養(yǎng)下長成數(shù)百微米的絲狀菌體，PHB含量從68.69%提升至82.04%，即使在振蕩培養(yǎng)下菌絲長度依然是出發(fā)菌株的1.4倍。

為了解決Fts Z和Mer B非正常表達(dá)后細(xì)胞數(shù)量減少的問題，Jiang等構(gòu)建了溫度敏感表達(dá)質(zhì)粒，菌體在30℃時正常生長到預(yù)定生物量后升高至37℃，F(xiàn)ts Z和Mer B表達(dá)受限，菌體細(xì)胞膜剛性遭到破壞、細(xì)胞分裂受到抑制，從細(xì)桿狀轉(zhuǎn)向粗絲狀的菌體可以實(shí)現(xiàn)更多PHAs的積累。這一舉措既實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵前期生物量積累、發(fā)酵后期菌體存儲空間增大的目的，又消除了基因工程手段對發(fā)酵前期細(xì)胞生長的負(fù)面影響。

除了形態(tài)調(diào)控，基因工程還適用于構(gòu)建中間物的合成代謝途徑。大部分菌株需利用多種碳源合成共聚物PHAs，例如在培養(yǎng)基中同時提供葡萄糖和丙酸才能獲得共聚物P(3HB-co-3HV)。為了解決這個問題，Tan等強(qiáng)化蘇氨酸合成途徑的同時敲除2-甲基檸檬酸合酶，胞內(nèi)丙酰Co A濃度上升，重組鹽單胞菌TD01實(shí)現(xiàn)了單一碳源下P(3HB-co-3HV)的生物合成。同樣的，在單一碳源下，Li等通過敲除琥珀酸半醛脫氫酶基因和過表達(dá)orf Z，胞內(nèi)碳通量流向4HB-Co A的合成，為共聚物P(3HB-co-4HB)的合成提供前體。構(gòu)建中間物的合成代謝途徑，一方面避免了使用其他脂肪酸導(dǎo)致的原料成本增加和可能帶來的毒性作用，另一方面為利用微生物直接合成多種類PHAs提供了指導(dǎo)方向。

聲明：本文所用圖片、文字來源《生物工程學(xué)報》2021年2月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：脂肪酸酯，3羥基丁酸酯，草酰乙酸，琥珀酸