2.2 EGCG穩(wěn)定性的改變對(duì)NCM460細(xì)胞的胞內(nèi)、外H₂0₂濃度影響

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)H₂0₂水平的檢測(cè)

對(duì)比不同處理時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)H₂0₂濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；與對(duì)照組0μmol/L相比，H₂0₂濃度lh內(nèi)出現(xiàn)了短暫增高，其中80μmol/L組極顯著增高(P＜0.001)(圖6a)，處理3h后，與對(duì)照組相比高濃度EGCG中的H₂0₂濃度出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)(圖6c)，這種現(xiàn)象在處理12h后更顯著(P＜0.001)(圖6d)。

2.2.2 胞外H₂0₂水平的檢測(cè)

結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)體系中H₂0₂濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；對(duì)比相同時(shí)間不同濃度組發(fā)現(xiàn)，處理2、3、6、12h后，20、40、80μmol/L的處理體系H₂0₂濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，即培養(yǎng)體系巾的H₂0₂濃度隨時(shí)問(wèn)延長(zhǎng)和EGCG濃度的增加而顯著上升，處理24h后胞外的H₂0₂水平出現(xiàn)明顯降低，見(jiàn)圖7。

3 討論

EGCG的多種生物活性已在細(xì)胞培養(yǎng)模型中得到證實(shí)，其中最顯著的為抗氧化、抗炎和抗癌作用，這表明EGCG很可能成為因ROS增加和/或細(xì)胞抗氧化能力不足引發(fā)的退行性疾病的臨床藥物。然而，EGCG在相應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果是存在爭(zhēng)議的。依據(jù)EGCG結(jié)構(gòu)特征，其在細(xì)胞培養(yǎng)物中和整個(gè)生物體中的活性不一致可能歸因于EGCG分子的穩(wěn)定性不足，EGCG不受控的降解或聚合，不僅會(huì)導(dǎo)致體外研究結(jié)論不準(zhǔn)確，還會(huì)限制EGCG在體內(nèi)的生物利用度。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的溶液環(huán)境對(duì)EGCG的氧化聚合有較明顯影響，在DMEM培養(yǎng)液中EGCG的聚合效率更高，而H2O的影響較小，這與Krupkova等的研究結(jié)果吻合；高溫促進(jìn)了EGCG的自動(dòng)氧化，Krupkova等也證實(shí)低溫可以保持EGCG的穩(wěn)定性；不同EGCG濃度下EGCG的氧化聚合程度不同，高濃度促進(jìn)EGCG的聚合，同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)問(wèn)的增長(zhǎng)，EGCG的聚合物增多；溶液pH對(duì)EGCG的穩(wěn)定性也有較明顯影響，EGCG在酸性環(huán)境中更加穩(wěn)定(pH＜6)，這與相關(guān)研究相符。由此可見(jiàn)，溶液環(huán)境、溫度、反應(yīng)時(shí)問(wèn)、EGCG濃度和溶液pH等因素均會(huì)影響EGCG的穩(wěn)定性，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)給予考慮。已有研究證實(shí)，環(huán)境是確定EGCG抗淀粉樣蛋白功效的關(guān)鍵因素，因此，解析EGCG穩(wěn)定性的環(huán)境條件對(duì)于進(jìn)一步研究其在機(jī)體中發(fā)揮功效的機(jī)制有重要意義。

在正常培養(yǎng)細(xì)胞體系巾探討了EGCG的穩(wěn)定性對(duì)其抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)胞外H₂0₂水平在時(shí)間和濃度效應(yīng)上與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)，而胞內(nèi)出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。研究分析，EGCG在培養(yǎng)體系中會(huì)發(fā)現(xiàn)氧化聚合反應(yīng)，生成H₂0₂；隨后，H₂0₂進(jìn)入細(xì)胞，使胞內(nèi)H₂0₂水平迅速上升，給細(xì)胞造成氧化脅迫，激活胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對(duì)脅迫，隨著抗氧化酶系的積極響應(yīng)，胞內(nèi)H₂0₂水平出現(xiàn)短暫上升然后開(kāi)始下降，最終表現(xiàn)為EGCG處理后，細(xì)胞內(nèi)H₂0₂濃度低于未處理細(xì)胞，表現(xiàn)為抗氧化效應(yīng)，特別是20μmol/L組，這一過(guò)程可能是EGCG發(fā)揮生物活性，特別是在抗增殖和癌癥治療中的潛在作用。如20μmol/L的EGCG是其通過(guò)預(yù)警響應(yīng)發(fā)揮抗氧化活性的最適濃度，隨著EGCG濃度的升高，氧化聚合反應(yīng)產(chǎn)生的H₂0₂水平超過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激范圍，可能對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，詳細(xì)分子機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基較H₂0₂更促進(jìn)EGCG的氧化聚合，低溫低EGCG濃度及酸性條件利于EGCG的穩(wěn)定，同時(shí)EGCG的氧化聚合隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而加劇。存含有細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，EGCG也會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化聚合并產(chǎn)生H₂0₂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外的H₂0₂濃度升高，但胞內(nèi)H₂0₂濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。研究結(jié)果提示，一定濃度的EGCG在培養(yǎng)細(xì)胞中可能通過(guò)氧化聚合產(chǎn)生H₂0₂，形成氧化脅迫，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)H₂0₂濃度隨后降低，表現(xiàn)出抗氧化效應(yīng)。

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