金銀花來(lái)源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThumb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效。歷代對(duì)金銀花的炮制方法主要有炒黃、炒炭、蜜炙等?！吨袊?guó)藥典》2015年版僅收載了金銀花，但山東、天津、上海、安徽、江西、廣東、廣西等省市炮制規(guī)范均收載了金銀花炭。金銀花炒炭后寒性減弱，并具有澀性和止血作用，善清解下焦及血分之熱毒。

現(xiàn)代研究表明，金銀花主要含有有機(jī)酸類、黃酮類等多種活性成分，有機(jī)酸類成分主要有綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等，黃酮類成分主要有槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、木犀草素等。綠原酸具有抗菌、解熱、抗炎作用，咖啡酸具有抗炎、止血作用，槲皮素可降低小鼠出凝血時(shí)間，木犀草素具有抗炎、止血作用。金銀花炒炭后綠原酸含量明顯降低，咖啡酸、槲皮素、木犀草素3種止血成分的含量顯著增加。金銀花炭品混懸液、水煎液較其生品止血作用更顯著，臨床多用于治療各科出血性疾病。但目前對(duì)金銀花炭止血作用的研究，多以正常動(dòng)物或體外實(shí)驗(yàn)為主，止血機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)參閱文獻(xiàn)，從血熱出血模型大鼠的一般體征變化、體溫改變、凝血功能指標(biāo)以及胃出血和損傷情況等方面，研究金銀花炒炭前后涼血止血作用變化。

1儀器與材料

1.1儀器

AYW8000半自動(dòng)凝血分析儀(南京瑞麥科技開(kāi)發(fā)有限公司)；H3-18KR型低溫冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；MK-30型電熱控溫炒藥機(jī)(江陰市祝塘明科機(jī)械廠)；FA2004型電子天平(十萬(wàn)分之一，上海上平儀器有限公司)；D4-6050型真空干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2藥品與試劑

金銀花購(gòu)自山東建聯(lián)嘉盛中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾。金銀花炭：按課題組前期優(yōu)選出的炒炭工藝制備。取凈金銀花，置電熱控溫炒藥機(jī)內(nèi)(設(shè)定炒制溫度為250℃，炒制4min，炒藥機(jī)轉(zhuǎn)速為40r/min)，成品表面焦褐色，具焦香氣，得率80.78%。

云南白藥(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)Z53020798)；干酵母(安琪酵母股份有限公司)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20170614)；枸櫞酸鈉(天國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑，批號(hào)20170327)；其余化學(xué)試劑均為分析純。試劑盒：凝血酶原時(shí)間(PT，批號(hào)20171030)、凝血酶時(shí)間(TT，批號(hào)20171030)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT，批號(hào)20171030)，均購(gòu)置于南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物

SD雄性大鼠，體重180～220g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。

2方法

2.1供試液的制備

2.1.1大鼠灌胃液的制備

稱取金銀花炭粗粉300g、金銀花粗粉368.41g(按得率計(jì)算，相當(dāng)于炒金銀花炭300g)，加10倍量水浸泡30min，回流提取30min，濾過(guò)；藥渣再加8倍量50%乙醇回流提取30min，濾過(guò)；藥渣再加乙醇回流提取30min，濾過(guò)；合并3次濾液，減壓濃縮成浸膏。取浸膏，加入0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，制成質(zhì)量濃度為0.60g/mL的大鼠灌胃液。

2.1.2干酵母混懸液的制備

取干酵母20g，加蒸餾水，研磨均勻，定容至100mL容量瓶中，制成濃度為20%的酵母混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.3云南白藥混懸液的制備

精密稱取云南白藥粉末6.25g，研磨均勻，加入0.5%CMC-Na溶液配制成0.025g/mL的云南白藥混懸液。

2.2分組、造模及給藥

取SD雄性大鼠，置于溫度為18～25℃、相對(duì)濕度為45%～75%的動(dòng)物飼養(yǎng)房環(huán)境中適應(yīng)性5天。分組前剔除不正常體溫(小于36.5℃或大于38.5℃)或連續(xù)兩次測(cè)體溫波動(dòng)大于0.5℃的大鼠，然后隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、云南白藥組、金銀花組、金銀花炭組，每組10只。空白組自由飲水，其余各組以5%乙醇代替自由飲水，連續(xù)7天。第8天開(kāi)始灌胃，給藥組分別灌胃給予金銀花生品與炭品灌胃液，空白組與模型組灌胃給予等體積的0.5%CMC-Na溶液，云南白藥組灌胃給予云南白藥混懸液(給藥劑量見(jiàn)表1)，每日2次，連續(xù)給藥7天，于第13天，空白對(duì)照組于背部?jī)蓚?cè)皮下注射等量生理鹽水，其余各組于背部?jī)蓚?cè)皮下注射20%的干酵母混懸液，注射劑量為10mL/kg。

2.3一般體征觀察

2.3.1大鼠體重增長(zhǎng)率測(cè)定

分別于實(shí)驗(yàn)第7天和第14天，測(cè)定各組大鼠的體重并計(jì)算各組體重增長(zhǎng)率。

體重增長(zhǎng)率(%)=(第14天體重-第7天體重)/第7天體重×100%

2.3.2大鼠飲食量、飲水量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液后，將各組大鼠的飲食量、飲水量進(jìn)行48h檢測(cè)，并計(jì)算各組大鼠每100g體重的飲食量和飲水量，取其平均值。

2.3.3大鼠糞便含水量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液2h后，對(duì)各組每只大鼠取新鮮糞便1粒，稱其濕重，置烘箱105℃干燥5h后，冷卻至恒重，稱其干重，并計(jì)算糞便含水量，取其平均值。

糞便含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%

2.3.4大鼠肛溫測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液后檢測(cè)各組大鼠的肛溫變化，每隔2h測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定5次。

2.4大鼠血液內(nèi)外源性凝血功能指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第14天，大鼠灌胃給藥1h后，將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3.8%枸櫞酸鈉1∶9(V∶V)抗凝，全血以3000r/min離心10min，取血漿，測(cè)定血漿內(nèi)外源性凝血功能指標(biāo)(PT、APTT、TT)。PT、APTT、TT各指標(biāo)按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

2.5大鼠胃出血及損傷情況觀察

實(shí)驗(yàn)第14天，大鼠取血后處死，剖腹取胃組織，用生理鹽水沖洗，浸于10%福爾馬林溶液中，肉眼觀察胃黏膜出血及損傷情況并拍照。

2.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)及方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x¯±s表示，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1金銀花炒炭前后對(duì)血熱出血模型大鼠體重增長(zhǎng)率、飲食量、飲水量、糞便含水量的影響

模型組組與空白對(duì)照組相比，大鼠體征發(fā)生了一系列變化，包括體重減輕，飲食量減少，飲水量增加，糞便含水量降低，大便顏色較黑，且干結(jié)顆粒變小，精神狀態(tài)較活躍，毛色干枯變黃，部分大鼠鼻內(nèi)及耳蝸深處有出血現(xiàn)象。各給藥組與模型組比較，大鼠體重、飲食量均增加，飲水量減少，糞便含水量增加，大便稍軟，活動(dòng)量相對(duì)減少，毛色好轉(zhuǎn)，大鼠鼻內(nèi)及耳蝸深處出血消失。記錄并分析各組大鼠給藥后一般體征變化。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2金銀花炒炭前后對(duì)血熱出血模型大鼠體溫的影響

大鼠背部?jī)蓚?cè)皮下注射20%的干酵母混懸液，并結(jié)合無(wú)水乙醇的化學(xué)刺激作用，可引起大鼠肛溫在第2h后明顯升高，與空白組相比，模型組大鼠發(fā)熱過(guò)程穩(wěn)定，能8h維持高溫，說(shuō)明熱證模型復(fù)制成功。與模型組相比，陽(yáng)性組無(wú)明顯差別，表明云南白藥在大鼠體溫調(diào)節(jié)中樞中不起調(diào)節(jié)作用；金銀花組和金銀花炭組均能顯著抑制酵母菌導(dǎo)致的大鼠體溫升高，但金銀花組優(yōu)于金銀花炭組，表明金銀花生品的涼血作用強(qiáng)于炭品。結(jié)果見(jiàn)表2。

4討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，血熱妄行出血是指熱邪侵入體內(nèi)，致氣分熱、血分熱，血熱則郁結(jié)、互搏，血盛則瘀，則出血，為臨床常見(jiàn)疾病。本實(shí)驗(yàn)采用5%乙醇長(zhǎng)時(shí)間化學(xué)刺激大鼠胃，導(dǎo)致大鼠胃粘膜灼燒制造出胃出血模型，并結(jié)合傳統(tǒng)的皮下注射干酵母混懸液制造出血熱模型，能夠避免采用乙醇造模法所致大鼠醉酒狀態(tài)，并且造模期間一直飲用5%乙醇，大鼠體內(nèi)對(duì)乙醇有適應(yīng)的過(guò)程，致使模型組大鼠和空白組大鼠的體內(nèi)代謝成分有較大的差異，在這一點(diǎn)上選擇的血熱出血?jiǎng)游锬Ｐ透鼮楹侠怼?/p>

本實(shí)驗(yàn)采用干酵母結(jié)合乙醇建立大鼠血熱出血模型，探究金銀花生、炭品對(duì)血熱出血模型大鼠體重增長(zhǎng)率、飲食量、飲水量、糞便含水量、肛溫、PT、APTT、TT及其胃組織出血和損傷的影響。結(jié)果表明，金銀花和金銀花炭均能顯著增加血熱出血模型大鼠體重和飲食量，降低模型大鼠飲水量、糞便含水量和直腸溫度，起到體溫中樞調(diào)節(jié)作用，其中，以生金銀花降溫作用更為顯著；金銀花炭可明顯縮短血熱出血模型大鼠PT、APTT及TT，改善血熱出血模型大鼠胃出血和胃潰瘍情況，其作用顯著強(qiáng)于金銀花生品。本研究結(jié)果表明，生金銀花涼血作用較強(qiáng)，止血作用較弱，炒炭后涼血作用減弱，止血作用增強(qiáng)。

PT反映外源性凝血系統(tǒng)，APTT反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，TT反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白、內(nèi)外源共同性凝血系統(tǒng)是否存在抗凝和纖溶亢進(jìn)。金銀花炭可明顯縮短血熱出血模型大鼠PT、APTT及TT，說(shuō)明金銀花炭的止血機(jī)制可能是通過(guò)影響內(nèi)外源性凝血系統(tǒng)起作用的。

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