甘油二酯（DAG）是指甘油中兩個羥基與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)得到的產(chǎn)物，是一種功能性油脂，它分為1,3-甘油二酯和1,2-甘油二酯兩種異構(gòu)體。研究表明其具有減少內(nèi)臟脂肪的積累、控制體重、降低血脂等功效。甘油二酯可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等。相對于化學(xué)法，酶法制備甘油二酯具有反應(yīng)體系條件溫和，產(chǎn)品純度較高，能耗低等優(yōu)勢。以花生油為原料，生產(chǎn)花生油甘油二酯，不但風(fēng)味獨(dú)特，而且原料豐富，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

目前報道分子蒸餾是分離甘油酯的最有效的技術(shù)，該技術(shù)主要有蒸餾溫度低、工作真空度高、物料受熱時間短以及分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，適用于高沸點(diǎn)、熱敏性及易氧化物料的分離。近幾年，油脂中的縮水甘油酯和反式脂肪酸受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。縮水甘油酯對人體具有致癌性，過去日本花王公司生產(chǎn)了“Econa健康烹調(diào)油”，但隨后檢測機(jī)構(gòu)在其中檢測出縮水甘油酯含量超標(biāo)，致使該產(chǎn)品不能在市場上銷售。研究表明縮水甘油酯形成的過程與其前體物質(zhì)有關(guān)，并將前體物質(zhì)歸結(jié)為單酰基甘油酯、二?；视王?、三?；视王ズ吐?。油脂在精煉脫臭過程中，高溫處理會使反式脂肪酸含量增加。油脂中還存在維生素E、植物甾醇等有益成分，在合成及純化過程中會有一定的損失。目前未有對分子蒸餾后花生油甘油二酯有益與有害成分的研究。本試驗通過分子蒸餾純化花生油甘油二酯，研究合成與純化前、后的甘油酯組成、脂肪酸組成、縮水甘油酯（GEs）及營養(yǎng)物質(zhì)的變化。這對加強(qiáng)控制油脂開發(fā)類食品的質(zhì)量安全，以及油脂行業(yè)的發(fā)展和人們的身體健康具有重要的科學(xué)研究意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

魯花一級花生油，南昌天虹超市；脂肪酸標(biāo)品（GLC463標(biāo)樣），NuChek.Prep公司；丙三醇、無水硫酸鈉、冰乙酸、氯化鈉等均為分析純級試劑；正己烷、甲醇、叔丁基甲醚、異丙醇、苯硼酸等為色譜純級試劑。Novozym435脂肪酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；3-氯-1,2-丙二酵（3-MCPD-d₅），加拿大TorontoResearchChemicals公司。

1.2儀器與設(shè)備

FA2204B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UIC-KDL1分子蒸餾，德國UIC公司；DSY-VI型氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌鍋，鄭州市亞榮儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；6890N型氣相色譜儀，美國Agilent公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司等。

1.3試驗方法

1.3.1酶解法生產(chǎn)甘油二酯

利用Novozym435脂肪酶在無溶劑體系下通過甘油解反應(yīng)制備甘油二酯，合成條件為：花生油與甘油物質(zhì)的量比1∶2，加酶量6%，反應(yīng)時間12h，反應(yīng)溫度70℃。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系進(jìn)行離心，分離反應(yīng)體系中的脂肪酶后，合成產(chǎn)物低溫儲存。

1.3.2分子蒸餾工藝研究

采取兩級分子蒸餾從合成產(chǎn)物混合物中分離和純化甘油二酯。首先，進(jìn)行一級分子蒸餾將產(chǎn)物體系中的脂肪酸、甘油一酯在較低溫度下與?；视突旌衔锓蛛x，一級分子蒸餾條件：蒸餾溫度180℃和200℃，冷凝溫度20℃，轉(zhuǎn)速200r/min，真空度0.1Pa，進(jìn)料速率2mL/min，然后通過二級分子蒸餾在200℃溫度以上從甘油三酯中分離出甘油二酯，考察二級分子蒸餾溫度對甘油二酯純度和得率的影響。

1.3.3甘油酯純度測定

采用正相高效液相色譜法測定。測定條件：檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（Model300S，美國Softa公司）；色譜柱：HypersilBDSCPS(5μm,250mm×4.6mm，美國Thermo公司）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；樣品質(zhì)量濃度：0.2mg/mL正己烷；流動相：正己烷（溶有0.4%的乙酸）和叔丁基甲醚（溶有0.4%乙酸）。采用梯度洗脫，洗脫程序：0～5min,100%正己烷；5～15min,100%～20%正己烷；15～17min,20%正己烷；17～17.1min,20%～100%正己烷；17.1～20min,100%正己烷。某種甘油酯的含量表示為該種甘油酯的峰面積占總的甘油酯峰面積的百分比。

甘油二酯的純度定義為

式中，MAG（%）———產(chǎn)物中甘油一酯含量；DAG（%）———產(chǎn)物中甘油二酯含量；TAG（%）———產(chǎn)物中甘油三酯含量；FFA（%）———產(chǎn)物中游離脂肪酸的含量。

1.3.4理化性質(zhì)測定

酸價采用GB5009.229-2016測定；過氧化值采用GB5009.227-2016測定；色澤采用GB/T22460-2008動植物油脂羅維朋色澤的測定。

1.3.5甘油三酯總脂肪酸組成分析

甘油三酯的脂肪酸組成參照本試驗堿法甲基化方法：取2mg甘油三酯，溶于1.5mL正己烷，加入40μL乙酸甲酯和100μL(0.5mol/L）甲醇鈉溶液，渦流混勻1min,37℃下反應(yīng)20min后，置于冰箱下層-20℃冷凍10min，取出后立即加入60μL草酸溶液，離心棄去沉淀，N₂吹干，GC分析甘油三酯脂肪酸組成。

1.3.6氣相色譜分析

色譜條件參照Cruz-Hernandez，色譜柱為CP-Sil88熔融石英毛細(xì)管柱（100m×0.25mm×0.2μm）。載氣為H₂，燃燒氣為H₂、N₂和空氣。FID溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃。氣相色譜程序升溫的時間為86min:45℃保持4min，以13℃/min的升溫速率將溫度升至175℃，保持27min后再以4℃/min的升溫速率升至215℃，保持35min。脂肪酸的分析參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜，脂肪酸的百分含量采用面積歸一化法確定（以峰值面積的百分比表示）。

1.3.7縮水甘油酯的測定

樣品處理：稱取2份油樣0.1g于100μL甲基叔丁基醚中，再向油樣中加入1μg3-MCPD-d5，分別標(biāo)記為A,B，渦旋振蕩兩支試管至油樣完全溶解。再向溶液中加入25g/L甲醇鈉的甲醇溶液200μL，渦旋1min。酯交換反應(yīng)的時間要控制在3.5～5.5min內(nèi)，不斷渦旋直至反應(yīng)液澄清，試管A中加入600μL酸化的氯化鈉溶液（200g/L），試管B中加入600μL酸化的溴化鈉溶液（600g/L）終止酯交換反應(yīng)。充分反應(yīng)后，兩支試管中再分別加入600μL的正己烷溶液，蓋上蓋子充分渦旋后離心5min(4000r/min），待反應(yīng)液分層后去除有機(jī)層。此步驟重復(fù)3次。衍生反應(yīng)：對于A,B試管，分別用600μL乙醚/乙酸乙酯混合溶劑（3∶2）反萃取其水相，充分渦旋后離心5min(4000r/min），待溶液分層后把有機(jī)相合并在裝有少量無水硫酸鈉的2mL離心管中，此步驟重復(fù)3次。再分別向有機(jī)相中加入200μL衍生化試劑（PBA溶于乙醚中飽和），充分渦旋后在30℃下反應(yīng)20min。純化復(fù)溶：衍生化反應(yīng)結(jié)束后，用小氣流氮?dú)獯蹈?，氮吹溫度?5℃。氮吹完后，加入500μL異辛烷復(fù)溶，充分渦旋后離心1min(6000r/min），取200μL上層清液轉(zhuǎn)移至GC瓶中，供GC-MS分析。氣相色譜測定條件：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL，載氣為He,1.2mL/min恒速流動；升溫程序為60℃，以6℃/min上升至130℃，保持8min，再以20℃/min上升至250℃并保持5min。質(zhì)譜條件：EI+,SIM模式；EI離子源溫度230℃，EI電離能量70eV；接口溫度280℃；溶劑延遲6min；選擇3-MCPD-d5m/z為201,150;3-MCPDm/z為196,147定性定量。

1.3.8甾醇的測定

精確稱取0.05～0.1g（精確至0.1mg）的樣品置于帶蓋的試管中，加入5.0mL2mol/L氫氧化鉀的乙醇溶液后加蓋密封，劇烈振搖30s，置于60℃水浴中皂化1h，并保持振搖，用水冷卻至室溫后加入1.0mL二次水和4.0mL正己烷，密封后劇烈振搖，靜置，將上層（正己烷層）轉(zhuǎn)移至另一試管中，用N2吹干正己烷后加入1mL甲醇溶解，用0.45μm微孔濾膜濾過并轉(zhuǎn)至進(jìn)樣瓶中，在試驗設(shè)定條件下進(jìn)行HPLC測定。液相色譜分析條件參見江海、馮妹元等和牟德華等的方法，并在此基礎(chǔ)上作少許改動，采用二極管陣列檢測器（DAD），條件如下：色譜柱：HypersilODS2-C18(5μm,4.6mm150mm）流動相：純甲醇。流速：1.0mL/min。檢測波長：210nm。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10L。分析時長：20min。

1.3.9維生素E的測定

稱取一定量VE標(biāo)品，記錄下質(zhì)量，用正己烷定容。再從其中依次分別精確移取0.5,1,2,3,4,6mL，稀釋至10mL。采用HPLC分析，每個樣品平行測3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取1g菜籽油于10mL棕色容量瓶中，正己烷定容。經(jīng)0.45μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣。

色譜柱：依利特HypersilODS2(5μm,4.6mm×150mm），流動相為甲醇：水（體積比98∶2），進(jìn)樣5μL，流速設(shè)置為0.8mL/min，紫外檢測波長：λex=295nm，柱溫：25℃。

1.4統(tǒng)計方法

用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以及圖表繪制，檢測結(jié)果用Mean±SD表示；所有試驗均重復(fù)3次以上，并且用單因素方差分析比較均值，P<0.05為顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1合成及分子蒸餾前、后甘油酯組成液相色譜圖

圖1分別為混合甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品、合成甘油酯及分子蒸餾一次和二次的液相圖譜，橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)信號，出峰順序依次為FFA、TAG、1,3-DAG、1,2-DAG和MAG，分離效果很好。分子蒸餾一次后可除去游離脂肪酸和甘油一酯。分子蒸餾二次后可只保留甘油二酯組分。

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