銀杏（Ginkgobiloba）為銀杏科銀杏屬植物，是我國特有的中生代孑遺樹種。銀杏種仁（白果）為衛(wèi)計委認定的藥食同源物質(zhì)，具有益氣、潤肺和定喘等功能。銀杏營養(yǎng)成分豐富，干制品中蛋白含量13.2%，碳水化合物含量72.6%，粗脂肪含量1.3%，此外還含有豐富的維生素E及多種礦質(zhì)元素。銀杏蛋白以清蛋白和球蛋白為主，氨基酸組成合理，必需氨基酸占比高，屬于優(yōu)質(zhì)植物蛋白。鄧乾春等研究表明，銀杏白蛋白具有較好的清除超氧陰離子和拮抗DNA氧化損傷的活性，銀杏清蛋白可通過免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力發(fā)揮對衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180腫瘤小鼠的保護作用。

植物蛋白的提取有物理壓榨和溶劑浸提法等，其中溶劑浸提法是最常使用的方法。溶劑浸提法主要有水提酸沉法（waterextractionandacidprecipitation,WEAP）、堿提酸沉法（alkaliextractionandacidprecipitation,AEAP）和鹽提鹽析法，以及各種輔助提取技術，如超聲輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取、反膠團萃取和雙水相萃取等。目前已有數(shù)篇關于銀杏蛋白提取工藝的研究報道，李盼盼等優(yōu)化了銀杏蛋白超聲輔助提取的工藝參數(shù)，賈韶千等報道了銀杏蛋白堿法提取的最佳工藝，陳西娟考察了銀杏蛋白的鹽提鹽析法的工藝條件。研究表明功能活性物質(zhì)的結構、理化性質(zhì)和生物活性會受到提取方法的影響。彭倩等發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法和鹽溶法提取的腰果蛋白的結構和功能特性具有顯著性差異。職士淇等研究表明超聲輔助堿提、鹽提和水提制備的青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的功能特性各有優(yōu)劣。有關提取方法對銀杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未見報道。

本研究采用WEAP、AEAP和超聲輔助堿提酸沉法（ultrasound-assistedalkaliextractionandacidprecipitation,UA-AEAP）三種方法制備銀杏蛋白，考察提取方法對銀杏蛋白溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等功能特性的影響，同時考察提取方法對銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基能力和清除羥基自由基能力的影響，旨在為銀杏蛋白資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮銀杏2020年10月采自江蘇邳州；牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）、菲啰嗪美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。FA2104N電子分析天平、723C可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀濟南海能儀器股份有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機北京四環(huán)科學儀器廠；TGL-16G型臺式離心機上海安亭科學儀器廠；SHZ-D（Ш)循環(huán)水式真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

新鮮銀杏去外種皮、脫殼后，60℃下烘干至恒重，粉碎過60目，加入4倍體積石油醚，浸泡24h脫脂，得到脫脂銀杏粉。

1.2.2 銀杏蛋白的制備

根據(jù)預實驗結果確定了不同提取方法的工藝參數(shù)。WEAP提取條件：取50g脫脂銀杏粉，按液料比20:1mL/g分別加入去離子水，提取溫度60℃，提取時間2h。AEAP提取條件：按液料比20:1mL/g將脫脂銀杏粉與NaOH溶液混合，調(diào)pH10.0，提取溫度60℃，提取時間2h。UA-AEAP工藝參數(shù)：液料比20:1mL/g，超聲功率200W，超聲處理時間20min，提取溫度60℃，提取時間40min。提取后，3500r/min離心20min，收集上清液，調(diào)pH至銀杏蛋白的等電點4.4，4500r/min離心20min，所得沉淀透析（截留相對分子質(zhì)量3500Da）72h，濃縮，冷凍干燥，得銀杏蛋白。

1.2.3 銀杏蛋白得率及其化學成分的測定

蛋白含量的測定：GB50095-2016凱氏定氮法；總糖含量的測定：苯酚硫酸法；粗脂肪含量的測定：5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量的測定：GB5009.4-2016重量分析法。

銀杏蛋白得率計算公式如下：

1.2.4 銀杏蛋白溶解度的測定

將100mg銀杏蛋白溶于20mL去離子水中，調(diào)pH為2～12，室溫下攪拌30min，4500r/min離心20min，收集上清液?？捡R斯亮藍法測定上清液中銀杏蛋白的含量。

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

定取500mg銀杏蛋白分散于15mL0.01mol·L^-1磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，記錄初始體積為V₁（mL），10000r/min均質(zhì)2min，記錄泡沫體積為V₂（mL），靜置30min記錄體積記為V₃（mL）。銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計算公式如下：

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

取200mg銀杏蛋白分散于20mL0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，室溫下攪拌30min，加入5mL大豆油，10000r/min均質(zhì)2min。吸取100μL乳液，加入5mLSDS，混勻，測定500nm處的吸光度。銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的計算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)；A₁和A₂分別為0和30min時的吸光度；c為蛋白濃度，g/mL；θ為乳液中油相體積分數(shù)；Δt為兩次吸光度測定的間隔時間，min。

1.2.7 亞鐵離子螯合能力測定

采用Decker報道的方法，并稍加修改。將1mL銀杏蛋白溶液（0.01～10g/L）與3.7mL55%（v/v)乙醇、0.1mL氯化亞鐵（2mmol/L）和0.2mL菲啰嗪（5mmol/L）混勻，靜置20min，測定562nm處的吸光度。55%乙醇代替樣液作為空白對照。EDTA（0.01～10g/L）作為陽性對照。亞鐵離子螯合率計算公式如下：

亞鐵離子螯合率(%)=(A_b-As)/A_b×100式（6）

式中：A_b和As分別為空白對照組和樣品組的吸光度。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測定

參考Wu等報道的方法。取1.5mL銀杏蛋白溶液（0.1～6g/L），加入1.5mLDPPH溶液（0.2mmol/L），混勻，室溫下置于暗處30min，測定517nm處的吸光度。抗壞血酸（0.05～4g/L）做陽性對照。

式中：Ac為1.5mL蒸餾水與1.5mLDPPH混合液的吸光度；As為1.5mL樣液與1.5mLDPPH混合液的吸光度；A_b為1.5mL樣液與1.5mL95%乙醇混合液的吸光度。
 

相關鏈接：石油醚，菲啰嗪，抗壞血酸，磷酸鹽

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