一、目的要求

1、掌握微生物檢驗的一般方法。

2、學(xué)會果蔬中致病性大腸桿菌的測定方法。

二、實驗原理

根據(jù)大腸桿菌在一定條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以及生化指標(biāo)和血清學(xué)特征做出綜合判斷。

三、實驗試劑與儀器

1．培養(yǎng)基和試劑

①乳糖膽鹽發(fā)酵管：將20g蛋白胨、5g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)及10g乳糖溶于水中，校正pH至7.4，加入指示劑，分裝每管10mL，并放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。

②營養(yǎng)肉湯：將10g蛋白胨、3g牛乳膏及5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4，分裝燒瓶，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。

③腸道菌增菌肉湯：將10g蛋白胨、5g葡萄糖、20g牛膽鹽、8g磷酸氫二鈉、2g磷酸二氫鉀、0.015g煌綠溶于少量熱水中，然后稀釋至1000mL蒸餾水中，校正pH至7.2。分裝每瓶30mL，115⁰C高壓滅菌鍋15min。

④麥康凱瓊脂：將17g蛋白胨、3g脈胨、5g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)及5g氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中。校正pH至7.2。將17g瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒杯內(nèi)，121⁰C高壓滅菌15min，備用。臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加入10g乳糖，冷至50～55℃時加入10mL 0.01％結(jié)晶紫和5mL0.5％中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。

⑤伊紅美藍(lán)瓊脂(EMS)：將10g蛋白胨、2g磷酸氫二鉀和17g瓊脂溶解于1000mL蒸餾水中，校正pH至7.1，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時加入10g乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50～55℃，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。

⑥三糖鐵瓊脂(TSI)：將20g蛋白胨、5g牛肉膏、10g乳糖、10g蔗糖、lg葡糖糖、5g氯化鈉、0.2g硫酸亞鐵銨及0.2g硫代硫酸鈉溶于1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4。加入12g瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.025g 0.2％酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高檔的底層。121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆谩?/p>

⑦克氏雙糖鐵瓊脂(KI)：取兩份500mL血消化湯(pH=7.6)，分別加入6.5g，2g瓊脂，加熱溶解。第一份作為上層培養(yǎng)基，第二份作為下層培養(yǎng)基。在上層培養(yǎng)基中加入0.1g硫代硫酸鈉、O.1g硫酸亞鐵銨、5g乳糖及5mL0.2％酚紅溶液，分裝于燒瓶內(nèi)；在下層培養(yǎng)基中加入1g葡萄糖及5mL0.2％酚紅溶液，分裝于12mm×100mm滅菌試管內(nèi)，每管約2mL，115℃高樂滅菌10min。將上層培養(yǎng)基放在56％：水浴箱內(nèi)保溫；將下層培養(yǎng)基直立放在室溫內(nèi)，使其凝同。待下層培養(yǎng)基凝固后，以無菌手續(xù)將上層培養(yǎng)基分裝于下層培養(yǎng)基的上面，每管約1.5mL，放成斜面。

⑧糖發(fā)酵管：將10g蛋白胨、5g牛肉膏、3g氯化鈉、2g磷酸氫二鈉及12mL0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液溶于1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4。按0.5％加入所需糖類(如乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，12l⁰C高壓滅菌15min。

⑨賴氨酸脫酸酶試驗培養(yǎng)基：將5g蛋白胨、3g酵母浸膏、1g葡萄糖及1mLl.6％溴甲酚紫-乙醇溶液溶于少量熱水，然后稀釋至1000mL蒸餾水中，分裝每瓶100mL，分別加入各種所需氨基酸。再行校正pH至6.8。對照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL，上面滴加上一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。

⑩尿素瓊脂：將1g蛋白胨、5g氯化鈉、1g葡萄糖、2g磷酸二氫鉀及3mL0.4％酚紅溶液溶于1000mL蒸餾水中，并校正pH至7.2±0.1，加入20g瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶。121℃高壓滅菌15min。冷至50～55℃，加入經(jīng)除菌過濾的100mL 20％尿素溶液。尿素的最終濃度為2％，最終pH應(yīng)為7.2±0.1。分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩?/p>

2、儀器

采樣箱；滅菌攪拌棒；滅菌勺子、鑷子等；滅菌具塞廣口瓶；滅菌塑料袋；酒精燈；冰箱；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋；顯微鏡；離心機(jī)；酶標(biāo)儀；均質(zhì)器(或滅菌乳缽)；架盤藥物天平；細(xì)菌濃度比濁管；滅菌廣口瓶；滅菌錐形瓶；滅菌吸管；滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管；注射器；滅菌刀、剪、鑷子等；小白鼠；硝酸纖維素濾膜(150mm×50mm，0.45μm)，滅菌備用。

四、實驗步驟

1、增菌

樣品采集后應(yīng)盡快檢驗，除易腐食品在檢驗之前應(yīng)預(yù)冷藏外，一般不冷藏。以無菌手續(xù)稱取檢樣25g，加在225mL營養(yǎng)肉湯中，以均質(zhì)器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測定大腸菌群MPN值，其余的移入500mL廣口瓶內(nèi)，于(36±1)℃培養(yǎng)6h，取出一接種環(huán)，接種于一管30mL腸道菌增菌肉湯內(nèi)，于42⁰C培養(yǎng)18h。

2、分離

將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板。

污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，于(36±1)℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。

3、生化試驗

①自鑒別平板上直接挑取數(shù)個菌落分別接種于三糖鐵瓊脂或克氏雙糖鐵瓊脂上，同時將這些培養(yǎng)物分別接種于蛋白胨水、半固體瓊脂、pH=7.2的尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36⁰C培養(yǎng)過夜。

②TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸，H₂S陰性、KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希菌。

TSI底層不產(chǎn)酸，或H₂S、KCN和尿素等試驗中有任一項為陽性培養(yǎng)物，均非大腸埃希菌。

必要時可做氧化酶試驗和革蘭染色。

4、血清學(xué)試驗

①挑取經(jīng)生化試驗證實為大腸埃希菌的瓊脂培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希菌、侵襲性大腸埃希菌和產(chǎn)腸毒大腸埃希菌多價0血清和出血性大腸埃希菌0157血做玻片凝集試驗。當(dāng)與某一種多價血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。如與某一單價0血清呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng)，即為假定試驗陽性。

致瀉性大腸埃希菌所包括的0抗原群有EPEC、EHEC(如0157)、EIEC和ETEC諸類群，參見有關(guān)致瀉性大腸埃希菌的0抗原菌群。

②證實試驗：制備0抗原懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當(dāng)濃度。原效價為1:600～1:320的0血清，用0.5％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm的管內(nèi)等量混合，做單凝集試驗?；靹蚝蠓湃?0⁰C水浴箱內(nèi)，經(jīng)16h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實為該0抗原。

五、結(jié)果報告

綜合生化試驗、血清學(xué)試驗作出報告。

六、注意事項

細(xì)菌的分裂是無規(guī)律的，因此為了獲得足夠的統(tǒng)計準(zhǔn)確度，要求進(jìn)行5管平行試驗。

參考資料：食品中有毒有害物質(zhì)檢測

相關(guān)鏈接：大腸桿菌，乳糖膽鹽發(fā)酵管，麥康凱瓊脂，伊紅美藍(lán)瓊脂