魚腥草芩藍(lán)合劑為常見中藥制劑，由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花5味中藥材配制而成，具有清熱解毒的作用，臨床常用于治療外感風(fēng)熱引起的咽喉腫痛，急性咽炎、扁桃體炎等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，該制劑具有良好的解熱作用，臨床治療小兒皰疹性咽峽炎有較好的療效。魚腥草芩藍(lán)合劑收錄于國家藥品監(jiān)督管理局國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)中，然而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有魚腥草、黃芩、連翹和金銀花的薄層色譜鑒別項(xiàng)和黃芩苷含量的測定項(xiàng)，不能全面地反映復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。目前有關(guān)該制劑組分含量的測定研究較少，鄧茂芳等建立了高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測定魚腥草芩藍(lán)合劑中綠原酸、黃芩苷和黃芩素含量的方法。魚腥草芩藍(lán)口服液是同方配制的獸藥制劑，陸安等以魚腥草芩藍(lán)口服液為研究對象，建立了HPLC指紋圖譜鑒別方法，但未進(jìn)行含量測定研究；邢玉娟等建立了HPLC法測定魚腥草芩藍(lán)口服液中黃芩苷和綠原酸含量的方法。魚腥草中含有綠原酸、槲皮素、槲皮苷等化學(xué)成分；黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷等成分；連翹中含有綠原酸、槲皮素、槲皮苷、連翹酯苷A等成分；金銀花中含有綠原酸、槲皮素和槲皮苷等成分。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了HPLC法同時(shí)測定魚腥草芩藍(lán)合劑中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素7種成分含量的方法，為全面控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：UltimateU3000型，配有Chromeleon7.2SR5色譜工作站、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。電子天平：XPE205型，感量為0.01mg，瑞士梅特勒–托利多公司。超聲波提取器：ELMASONICP型，德國艾爾瑪公司。純水儀：MilliPAKadvantageA10型，美國密理博公司。復(fù)方魚腥草合劑樣品：某生產(chǎn)企業(yè)樣品。綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素、漢黃芩素對照品：批號分別為18071907、A19011704、18041002、19091104、18032111、19082203、18030509，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為96.1%、97.2%、93.3%、100.0%、98.5%、98.8%、99.1%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾公司。磷酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶劑配制

對照品單標(biāo)儲備液：分別精密稱取綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素對照品各約10mg，其中黃芩苷置于10mL容量瓶中，其它6種化合物分別置于100mL容量瓶中，各加入50%甲醇溶液溶解，稀釋，定容至標(biāo)線，配制成綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素的質(zhì)量濃度分別為98.5、102.4、994、97.8、101.2、98.8、103.2μg/mL的單標(biāo)儲備液。

混合對照品溶液：分別精密量取上述對照品單標(biāo)儲備液各1mL，置于同一只10mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素、漢黃芩素的質(zhì)量濃度分別為9.85、10.24、99.4、9.78、10.12、9.88、10.32μg/mL的混合對照品溶液。

1.3 樣品處理

精密量取魚腥草芩藍(lán)合劑2mL，置于20mL棕色容量瓶中，加入50%甲醇溶液12mL，超聲20min，冷卻至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：SymmetryShieldRP18柱(4.6mm×250mm，5μm，美國沃特世公司)；流動(dòng)相：乙腈–0.1%甲酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：初始乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%，0～30min，乙腈由20%逐漸增加至40%，保持30min，60～80min，乙腈由40%逐漸增加至80%；流量：1.0mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

所測7種化合物中，綠原酸為咖啡酰奎寧酸類，紫外光譜最大吸收峰為327nm；連翹酯苷A為苯乙醇苷類，最大吸收為330nm；其余成分為黃酮或黃酮苷類，黃芩苷最大吸收波長為278nm，槲皮苷為254nm和350nm，漢黃芩苷為276nm，槲皮素為370nm，漢黃芩素為276nm。各成分之間紫外最大吸收波長差別較大，但在210nm處均有較強(qiáng)的紫外吸收，故選擇210nm作為檢測波長同時(shí)檢測7種成分。

2.2 色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈–水溶液、乙腈–0.1%甲酸溶液和乙腈–0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，考察不同流動(dòng)相體系對7種待測成分的分離效果。結(jié)果表明，乙腈–0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形較好，故選擇乙腈–0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。由于7種待測化合物極性跨度較大，采用等度洗脫無法對所有化合物進(jìn)行分離，故采用梯度洗脫方式。對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終確定洗脫程序：初始乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%，0～30min，乙腈由20%逐漸增加至40%，保持30min，60～80min，乙腈由40%逐漸增加至80%。在此洗脫程序下，7種化合物在80min內(nèi)獲得較好的分離，峰形較好。

2.3 色譜柱選擇

分別對SymmetryShieldRP18柱(4.6mm×250mm，5μm)、AgilentZORBAXEclipseXDB柱（250×4.6mm，5μm）和ODSHHPERSIL柱(4.6mm×250mm，5μm)3種型號的色譜柱進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SymmetryShieldRP18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱分離效果最佳，故選擇該色譜柱進(jìn)行方法學(xué)考察和樣品測定。

2.4 樣品提取條件選擇

樣品為口服液體制劑，溶解性較好，但個(gè)別化合物濃度較高，故采用50%甲醇對樣品制劑稀釋10倍，過濾后直接進(jìn)樣測定。混合對照品溶液和樣品溶液色譜圖如圖1所示。

相關(guān)鏈接：綠原酸，連翹酯苷A，漢黃芩苷，槲皮素

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