黃漿水是豆腐加工過程中的副產(chǎn)物，富含大豆異黃酮、蛋白質(zhì)和維生素P、K等營養(yǎng)物質(zhì)，以及大量水溶性的糖類，如水蘇糖、棉籽糖、蔗糖等，通常被直接排放，既浪費資源又污染環(huán)境。黃漿水在貯藏的過程中可自然發(fā)酵為酸漿，是一種良好的豆腐凝固劑。與石膏、鹵水作為凝固劑的豆腐相比，酸漿豆腐質(zhì)地細(xì)膩、口感鮮嫩，深受人們喜愛。然而，自然發(fā)酵酸漿中含有大量的乳酸菌、酵母及其它微生物，也包括一些有害微生物，如蠟樣芽孢桿菌，造成酸漿質(zhì)量不穩(wěn)定，并對酸漿豆腐的安全性構(gòu)成威脅，從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

由于乳酸菌在酸漿形成過程中起主導(dǎo)作用，因此純種乳酸菌發(fā)酵制備酸漿成為趨勢。目前已有干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、解淀粉乳桿菌等多種乳酸菌應(yīng)用于黃漿水發(fā)酵中。由于人體不能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶，因此黃漿水中的主要低聚糖—水蘇糖和棉籽糖等不能被人體消化利用，在腸道中被細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氣，導(dǎo)致胃腸脹氣。研究表明有些乳酸菌，如鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等具有α-半乳糖苷酶活性，在發(fā)酵的過程中可利用大豆低聚糖緩解脹氣。另外，在乳酸菌發(fā)酵黃漿水的過程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，糖苷形式的大豆異黃酮可以轉(zhuǎn)化為更易吸收的游離型苷元大豆異黃酮，從而提高發(fā)酵黃漿水的抗氧化活性。

屎腸球菌（Enterococcusfaecium）屬于乳酸菌的一種，是腸道內(nèi)的正常菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品、泡菜、豆醬等發(fā)酵食品中，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強(qiáng)等特點，以及抑制病原菌、增強(qiáng)免疫力等作用。課題組前期從泡菜中篩選出1株屎腸球菌E.faeciumR2，該菌株可利用豆腐黃漿水中的低聚糖生長產(chǎn)酸，無需補(bǔ)充碳源和其它營養(yǎng)素即可達(dá)到豆腐凝固劑所需的酸度。采用該菌種純種發(fā)酵制備酸漿可有效降低大腸桿菌等的污染，既解決了自然發(fā)酵酸漿中微生物雜亂的問題，提高了酸漿豆腐的安全性，又可降低生產(chǎn)成本，具有廣泛的應(yīng)用前景。為了更好地了解屎腸球菌R2對豆腐黃漿水的發(fā)酵特性，本研究采用HPLC法對屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過程中的低聚糖、有機(jī)酸以及大豆異黃酮的組分和含量進(jìn)行測定與分析，監(jiān)控發(fā)酵過程中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的變化規(guī)律，并對發(fā)酵黃漿水的體外抗氧化活性進(jìn)行評價，揭示屎腸球菌R2的發(fā)酵功能特性，以期為屎腸球菌R2的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌E.faeciumR2，CGMCCNo.14944（專利保藏菌種），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，由淮南師范學(xué)院食品質(zhì)量與安全實驗室提供；食品級黃豆購于淮南蘇果超市；黃漿水，實驗室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Ｔrolox、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黃豆黃素、大豆黃素苷、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、棉籽糖、水蘇糖、蔗糖等標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；乙睛（色譜純）、乙酸（色譜純），天津科密歐化化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；對硝基苯酚、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，阿拉丁生化科技股份有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸二銨2g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，無水乙酸鈉5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫-801mL，121℃滅菌15min，冷卻備用。黃漿水培養(yǎng)基：將100mL黃漿水加入到250mL錐形瓶中，密封后121℃滅菌15min，冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CＪ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；LDZW-60KCS-ll型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；Ｔ6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5804R型離心機(jī)，Eppendorf公司；KQ-400B型超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司；HPLC2998高效液相色譜，Waters公司；250mm×4.6mm5μm氨基柱、250mm×4.6mm5μmＴhermoC18柱，Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 黃漿水的制備

以傳統(tǒng)工藝制作的鹵水黃漿水作為初級黃漿水，初級黃漿水接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36h制得一代酸漿。以一代酸漿做為凝固劑制得二級豆腐黃漿水，再接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36h制得二代酸漿。以二代酸漿做凝固劑制得三級豆腐黃漿水，如此循環(huán)三代后消除原鹵鹽凝固劑的影響，試驗采用三代以后酸漿點制豆腐過程中所產(chǎn)生的黃漿水。

1.3.2 樣品制備

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接入新鮮豆腐黃漿水培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)，獲得發(fā)酵0，12，24，36h的樣品，測定發(fā)酵過程中的屎腸球菌R2生物量和pH的變化趨勢。樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后供后續(xù)分析使用。

1.3.3 HPLC測定大豆低聚糖

色譜柱：Aglient氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉籽糖、水蘇糖）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃；檢測器：示差折光檢測器。大豆低聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

1.3.4 HPLC測定有機(jī)酸

色譜柱：AgilentZORBAXSB-Aq（250mm×4.6mm，5μm）；ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：10mmol/L磷酸氫二鉀（用磷酸調(diào)pH為2.55）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。檢測器：紫外檢測器；波長：210nm。有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

1.3.5 HPLC測定大豆異黃酮

色譜柱：ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。檢測器：紫外檢測器；波長：260nm。梯度洗脫條件按照GB/Ｔ26625-2011。大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

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相關(guān)鏈接：磷酸氫二鉀，黃豆黃素，大豆苷元，檸檬酸二銨