1.3.6 酶的定位及活性測定

1）粗酶液的制備

將屎腸球菌R2以3%接種量接種到黃漿水培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)，分別于12，24，36h取發(fā)酵液。發(fā)酵液于4℃下5000r/min離心10min，得菌液上清及沉淀；菌體沉淀用生理鹽水洗滌2次后，懸浮于2mL、pH=5.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，超聲功率130W，破碎時(shí)間15min，間隔時(shí)間2s。破碎后于4℃、12000r/min下離心10min，得菌體碎片和破碎上清；菌體碎片用5mL、pH=5.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗滌2次后溶于1mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液中用作酶活測定，菌液上清、破碎上清直接進(jìn)行酶活測定。

2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.1391g對(duì)硝基苯酚，精確到0.001g，用0.2mol/L碳酸鈉溶液定容至100mL，4℃下保存?zhèn)溆?。依次移取?duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液1，2，3，4，5，7，9mL，用0.2mol/L碳酸鈉溶液定容至100mL，配成濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9mmol/L的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

吸取1mL對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入1mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液；對(duì)照的空白試管中加入2mLpH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入8mL0.2mol/L碳酸鈉溶液，振蕩，在400nm處測定吸光值。以對(duì)硝基苯酚含量為X軸、吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.642X+0.006，R²=0.999。

3）酶活測定

將粗酶液、10mmol/L對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液和10mmol/L對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液分別于37℃水浴中預(yù)熱10min。然后吸取0.4mL粗酶液于干凈的試管中，分別加入0.4mL對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液或10mmol/L對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，破碎上清和破碎沉淀酶活測定以緩沖液代替粗酶液作為空白對(duì)照，菌液上清酶活測定以加熱使酶失活的上清液作為空白對(duì)照，于37℃中水浴10min后，加入3.2mL0.2mol/L碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，待冷卻至室溫后，將反應(yīng)液于400nm處測定吸光值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中菌液上清、破碎上清和破碎沉淀中的α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力。

酶活力單位定義：在37℃，pH5.0條件下，1min催化生成1nmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 對(duì)DPPH·清除能力的測定

參考劉力的方法略有修改，取2.0mL0.05g/LDPPH無水乙醇溶液，加入2.0mL發(fā)酵液，搖勻，置于25℃水浴中避光反應(yīng)30min后，于8000r/min下離心10min，期間注意避光。在517nm處測定吸光度值。蒸餾水作為對(duì)照，Ｔrolox作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-0.0285X+0.8299，R²=0.9907，結(jié)果以μgＴrolox/mL表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS18.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（One-wayANOＶA），利用Duncan’smultiplerangetest方法進(jìn)行顯著性分析，選取P＜0.05為顯著水平。采用OriginPro8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酸度的變化

豆腐黃漿水中含有小分子糖類、蛋白質(zhì)及一些生物活性物質(zhì)，適于微生物的生長，pH值可以反映屎腸球菌R2發(fā)酵黃漿水后形成的游離H+和有機(jī)酸的變化情況。圖1為屎腸球菌R2發(fā)酵黃漿水過程中OD值和pH的變化規(guī)律。從圖1中可以看出，屎腸球菌R2能夠利用豆腐黃漿水中的小分子糖類生長，降低黃漿水的pH值。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌體生長量逐漸增加，pH值逐漸下降，其中12～24h之間菌體生長最快，pH下降最明顯。

2.2 發(fā)酵處理對(duì)豆腐黃漿水中低聚糖含量的影響

2為屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過程中低聚糖含量的變化規(guī)律。新鮮豆腐黃漿水中5種糖的含量為19418.22mg/L，其中水蘇糖和蔗糖含量較高，水蘇糖含量占5種糖含量的58%，蔗糖含量占5種糖含量的30%，棉籽糖、葡萄糖和果糖的含量相對(duì)較低。在屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水的過程中，低聚糖含量均有不同程度的下降。發(fā)酵12h后，葡萄糖的含量迅速下降，利用率達(dá)到43%，其次為棉籽糖和果糖，利用率均為17%，水蘇糖和蔗糖的利用率較低，分別為4%和3%；發(fā)酵24h后葡萄糖基本利用完畢，無法檢出。此時(shí)，果糖的利用率達(dá)到68%，棉籽糖的利用率達(dá)到22%，水蘇糖和蔗糖的利用率均為12%。表明屎腸球菌R2在發(fā)酵豆腐黃漿水時(shí)優(yōu)先利用葡萄糖，其次為果糖和棉籽糖；發(fā)酵36h后，果糖的含量幾乎沒有發(fā)生變化（P＜0.05），蔗糖的利用率達(dá)到31%，棉籽糖和水蘇糖的利用率分別為38%和24%。因此，經(jīng)過屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，可以有效地緩解棉籽糖和水蘇糖引起的胃脹氣。

2.3 屎腸球菌R2α-半乳糖苷酶的定位及活性分析

棉籽糖和水蘇糖的代謝需要α-半乳糖苷酶，研究表明，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）、干酪乳桿菌（Lact.casei）、植物乳桿菌（Lactplantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lact.fermentum）、短乳桿菌（Lact.sbrevis）、布氏乳桿菌（Lact.buchneri）、腸膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）和羅伊氏乳桿菌（Lact.reuteri）等在發(fā)酵的過程中可以分泌α-半乳糖酶，將α-半乳糖苷類寡糖水解為可消化的糖類。屎腸球菌R2不同部位的α-半乳糖苷酶酶活見圖3。如圖3所示，菌液上清酶活幾乎為零，說明α-半乳糖苷酶沒有被分泌到細(xì)胞外，屎腸球菌R2的α-半乳糖苷酶不是胞外酶；細(xì)胞破碎并離心后，細(xì)胞破碎上清和破碎沉淀均具有酶活，說明屎腸球菌R2的α-半乳糖苷酶屬于胞內(nèi)酶；細(xì)胞破碎沉淀酶活顯著高于破碎上清酶活，說明該酶以可溶性蛋白和不可溶性蛋白兩種形式存在，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結(jié)果與Ames等的研究一致，其研究表明大多數(shù)α-半乳糖苷酶位于G+陽性菌細(xì)胞質(zhì)中。Mital等研究證明乳酸菌所產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶類的活性范圍在pH4.5～8.0，而屎腸球菌R2發(fā)酵36h后pH下降到3.58（圖1），嚴(yán)重偏離了該酶的最適pH，這導(dǎo)致了豆腐黃漿水中棉籽糖和水蘇糖被部分分解（圖2），而不是被全部降解，這一結(jié)果與付亭亭等的研究一致。

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