海灣扇貝(Argopectenirradians)是一種重要的經(jīng)濟類海洋貝類。海灣扇貝柱富含多種營養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)、脂肪、糖類質(zhì)量分數(shù)分別占14.03％，1.20％和3.07％，其中的總糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于巖扇貝(1.9％)、蝦夷扇貝(1.79％)及櫛孔扇貝(0.45％，極具開發(fā)價值。據(jù)報道，扇貝多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抗凝血等活性，已經(jīng)成為重要的功能食品資源。

由于扇貝不易貯藏，干制成為扇貝儲藏的主要手段。由于多糖與蛋白質(zhì)相連，而海洋貝類普遍具有高蛋白質(zhì)的特性，熱加工干制過程會加速兩者的結(jié)合，提取的多糖成分通常會含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)。為減輕蛋白質(zhì)對多糖結(jié)構(gòu)和生物活性研究的干擾，脫蛋白質(zhì)具有重要的意義。目前較普遍的蛋白質(zhì)脫除方法如：TCA法、Seveage法、酶法等，其中，Seveage法不適合食品加工行業(yè)。現(xiàn)階段對于扇貝多糖脫蛋白質(zhì)的研究多集中于多糖得率和蛋白脫除率上，如李雪梅等，乙醇沉淀法結(jié)合TCA法脫除海灣扇貝多糖的蛋白質(zhì)，脫除率達90％以上；劉禹等的研究表明，一種新興的D-葡萄糖酸-6-內(nèi)酯(GDL)蛋白質(zhì)脫除法，對蝦夷扇貝多糖的蛋白質(zhì)脫除率可達99％，效果優(yōu)于TCA法。

蛋白質(zhì)脫除方法在不同程度上都會影響到多糖的含量、得率或者活性，目前，關(guān)于蛋白質(zhì)脫除方式對多糖結(jié)構(gòu)、活性的影響鮮有報道。作者對干貝多糖進行不同方式的脫蛋白質(zhì)處理，并比較了蛋白質(zhì)脫除方式對干貝多糖結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響，以期找山干貝多糖的最佳脫蛋白質(zhì)方法，為研究干燥過程對干貝多糖的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為海灣鮮扇貝，由大連玉洋集團有限公司提供，鮮貝柱于50℃下烘干，自制為干貝柱，粉碎備用。術(shù)瓜蛋白酶(1×10⁵u/g)、堿性蛋白酶(2×10⁵u/g)：上海瑞永生物科技有限公司產(chǎn)品：氫氧化鈉(分析純)：沈陽市聯(lián)邦試劑廠產(chǎn)品；三氯乙酸(TCA)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；濃硫酸(分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)：阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品；過氧化氫(分析純)、水楊酸(分析純)：北京化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)產(chǎn)品；FeSO₄·7H₂0(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；苯酚、無水乙醇(分析純)：新光化工試劑廠產(chǎn)品；二苯基苦味肼基自由基(DPPH)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1便攜式折光儀：日本ATAGO公司產(chǎn)品：XH-C漩渦混勻儀：常州越新儀器制造有限公司產(chǎn)品：SYNERGYHI酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品：UDKl52全自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司產(chǎn)品：DY-200-BZ空氣浴振蕩搖床：廈門德儀設(shè)備有限公司產(chǎn)品：高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品：L-8900型氨基酸自動分析儀：日本HITACHI公司產(chǎn)品：G121M湘儀離心機：上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠產(chǎn)品：FD-1型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；Lambda25紫外-可見分光光度計：美國PerkinElmer公司產(chǎn)品：Sigma300掃描電子顯微鏡：卡爾蔡司(上海)管理有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 干貝粗多糖的提取

精確稱取適量干貝柱粉，以液料體積質(zhì)量比為40mL:1g加入去離子水，在80℃下熱水浸提4h后超聲9min。過濾濾渣，調(diào)整浸提液固形物質(zhì)量分數(shù)至10％，添加質(zhì)量分數(shù)2％的木瓜蛋白酶進行酶解，酶解時問3h、溫度57.8℃、pH7.1。離心取上清液，加入體積分數(shù)95％乙醇至乙醇最終體積分數(shù)為75％，4℃靜置12h后，離心取沉淀，揮醇后凍干，得干貝粗多糖(DAMP)。將DAMP配制成質(zhì)量濃度為50mg/mL的粗多糖溶液備用。

1.3.2 堿酶法蛋白質(zhì)脫除

參照韓瑩等的方法并略做改進。將粗多糖溶液pH值調(diào)至10，加入堿性蛋白酶使酶質(zhì)量分數(shù)為2％，于50℃酶解3h，沸水浴10min滅酶，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.3 稀堿法蛋白質(zhì)脫除

參照陳利華等的方法并略做改進。60℃下用0.1moL的NaOH溶液提取3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.4 FCA法蛋白質(zhì)脫除

參照李雪梅等的方法并略做改進。將質(zhì)量分數(shù)2％的TCA溶液與一定體積的粗多糖溶液等體積混合，震蕩反應(yīng)3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.5 GDL法蛋白質(zhì)脫除

參照劉踽等的方法并略做改進。向粗多糖溶液中加質(zhì)量分數(shù)2％的GDL溶液，使GDL的終質(zhì)量分數(shù)達到0.3％～0.5％。置于45℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.6 蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率的計算

采用苯酚-硫酸法測定多糖，采用凱氏定氮法舊測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，測定3組平行取平均值。蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率的計算公式如下：

式中：X₀為脫蛋白質(zhì)前樣品中蛋白質(zhì)量分數(shù)；X₁為脫蛋白質(zhì)后樣品中蛋白質(zhì)量分數(shù)。

式中：m₀為脫蛋白質(zhì)前樣品提取物質(zhì)量；m₁為脫蛋白質(zhì)后樣品提取物質(zhì)量。

1.3.7 單糖組成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定脫蛋白質(zhì)純化后多糖的單糖組成，具體操作參考文獻。

1.3.8 氨基酸組成分析

使用氨基酸自動分析儀測定氨基酸種類與含量，氨基酸質(zhì)量分數(shù)以mg/g表示。具體操作參考文獻。

1.3.9 剛果紅試驗

參照陳楊揚等的方法并略做改進。稱取多糖樣品各1mg，加入1mL蒸餾水和80μmol/L剛果紅溶液2mL，充分混勻后加入NaOH，使各組NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，并用紫外全波段掃描，記錄不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

1.3.10 掃描電鏡分析

參照Wang等的方法并略做改進。取適量經(jīng)蛋白脫除的多糖樣品，鍍上導(dǎo)電金粉后將其放置于掃描電鏡下觀察。工作條件：加速電壓15kV，觀測倍數(shù)分別選用200、1000、10000倍。

1.3.11 DPPH自由基清除能力的測定

參照Odeleye等的方法并略做改進。將待測樣品配制為30mg/mL的樣液，用無水甲醇依次稀釋成2、4、6、8、10mg/mL梯度。將2mL樣液與2mL0.16mmol/LDPPH-甲醇溶液(6.3lmg/dL)混合均勻。以VC作陽性對照，室溫下避光靜置30min后于517nm下用酶標(biāo)儀測定吸光值。每個濃度梯度進行3組平行試驗。DPPH清除率計算方式為：

式中：A₀為無水甲醇代替樣品的測得吸光度值；A₁為樣品溶液的測得吸光度值；A₂為無水甲醇代替DPPH測得的吸光度值。

1.3.12 羥基自由基清除能力的測定

參照Liu等的方法并略做改進。將待測樣品配制為30mg/mL的原液，依次稀釋成2、4、6、8、10mg/mL的溶液。將1mL樣液與1mL9mmol/LFeS04溶液、1mL9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1mL8.8mmol/L的H₂0₂溶液混合均勻，37℃水浴30min，以VC作陽性對照于510nm下測吸光值，清除率按下式計算：

式中：A₃為去離子水代替樣品的測得吸光度值；A₄為樣品溶液的測得吸光度值；A₅為去離子水代替H₂0₂溶液測得的吸光度值。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以(平均值±標(biāo)準偏差)表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSSStatistics17.0軟件進行單因素ANOVA分析，顯著性水平設(shè)定為0.05。

相關(guān)鏈接：水楊酸，過氧化氫，木瓜蛋白酶，二苯基苦味肼基自由基(DPPH)

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