目的

采用HPLC波長切換法同時(shí)測定喘舒片中鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。

方法

采用AgilentTC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長分別為245、278、254nm，流速1.0mL·min-1，柱溫35℃。結(jié)果鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的線性范圍分別為0.92～18.28（r=0.9989）、63.75～1275（r=0.9999）、11.07～221.4（r=0.9996）、6.07～121.40（r=0.9995）、1.20～24.10（r=0.9998）、1.20～24.08（r=0.9994）、2.08～24.16（r=0.9999）、2.89～57.88（r=0.9993）、1.79～35.80（r=0.9997）μg·mL-1；平均加樣回收率分別為98.62%、100.02%、99.84%、97.35%、98.38%、98.92%、100.23%、99.84%、97.74%，RSD分別為1.28%、1.61%、0.78%、1.02%、2.57%、1.80%、1.53%、1.29%、2.42%；9種成份在樣品中的含量分別為每片8.65×10-3～0.01104、49.460～57.464、0.864～1.883、0.215～0.388、0.0371～0.0866、0.0399～0.131、0.0464～0.0916、0.143～0.327、0.154～0.267mg。

結(jié)論

所用方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，靈敏度高，可用于喘舒片的質(zhì)量控制。

喘舒片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第三冊（標(biāo)準(zhǔn)號：WS3-B-0636-91），是由升華硫、大黃粉、鹽酸克倫特羅和黃芩提取物（以黃芩苷計(jì)）組成的中西藥復(fù)方制劑，適用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫，尤其是實(shí)喘息性氣管炎的治療。方中大黃具抗菌、消炎、止血的作用；升華硫、鹽酸克倫特羅能止咳、化痰、定喘，用于防治支氣管哮喘、慢性喘息性支氣管炎、肺氣腫等疾病所致的支氣管痙攣；黃芩提取物清熱燥濕，尤善清上焦熱邪，具抑菌、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、緩解哮喘、解痙攣等作用。諸藥相和，達(dá)到清肺熱、化痰定喘的功效。國內(nèi)有河南華峰制藥有限公司和山東百維藥業(yè)有限公司兩家喘舒片生產(chǎn)企業(yè)，前者采用HPLC法分別對鹽酸克侖特羅和黃芩苷進(jìn)行單組分含量測定，后者采用UV法控制鹽酸克侖特羅的含量。文獻(xiàn)報(bào)道中有關(guān)喘舒片指標(biāo)性成分的含量測定多見于單一藥味成分的研究，課題組前期曾采用HPLC法同時(shí)測定了喘舒片中5種蒽醌類成分的含量。中西藥復(fù)方制劑的療效是由多組分共同作用的結(jié)果，單一組分的定量分析難以實(shí)現(xiàn)對制劑整體質(zhì)量控制的目的，為全面有效地控制喘舒片的質(zhì)量，現(xiàn)采用HPLC波長切換法同時(shí)測定喘舒片中鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等9種成分的含量，為全面評價(jià)喘舒片的整體質(zhì)量提供了依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫）。鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等對照品（100072-201503、110715-201619、111595-200503、111514-200403、110795-201007、0757-200206、110756-201512、110796-201520、110758-201013，含量分別為90.5%、93.5%、99.8%、99.8%、98.0%、98.8%、98.7%、99.2%、99.8%）。喘舒片（河南華峰制藥有限公司，批號分別為：20180104、20181101、20190802、20191001、20191101；山東百維藥業(yè)有限公司，批號：20190412）；乙腈為色譜純；磷酸為優(yōu)級純；水為純凈水。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性的試驗(yàn)

采用AgilentTC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5min、50%A，5～35min、50%～70%A，35～55min、70%～75%A，55～60min、75%～50%A），流速1.0mL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL，檢測波長分別為245nm（鹽酸克侖特羅）、278nm（黃芩苷、黃芩素）、254nm（蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）。

取混合對照品、供試品及各陰性樣品溶液各10μL，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1）。各待測成分色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，各組分吸收峰的理論板數(shù)均不低于3.0×103，陰性樣品溶液圖譜顯示其他成分對9種待測成分無干擾。

1.2.2溶液的制備

精密稱取鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得分別含18.28μg·mL-1鹽酸克侖特羅、1.275mg·mL-1黃芩苷、0.2214mg·mL-1黃芩素、121.4μg·mL-1漢黃芩素、24.1μg·mL-1蘆薈大黃素、24.08μg·mL-1大黃酸、24.158μg·mL-1大黃素、57.88μg·mL-1大黃酚、35.80μg·mL-1大黃素甲醚的混合對照品溶液。

取喘舒片供試品適量，除去包衣，研細(xì)，取1.0g細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，取出，冷卻至室溫，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按喘舒片的處方和制備方法，分別制備缺鹽酸克侖特羅、缺黃芩提取物、缺大黃粉的陰性樣品，同法分別制成各陰性樣品溶液。

1.2.3線性關(guān)系的考察

精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1、2、5、8、10mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，制得系列濃度對照溶液。分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，線性范圍及相關(guān)系數(shù)（表1）。

1.2.4精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性的試驗(yàn)

精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.21%、0.74%、0.48%、1.72%、0.89%、1.51%、0.60%、1.43%、1.83%，表明儀器的精密度良好。取喘舒片樣品（批號：20191101），按“1.2.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的RSD分別為2.23%、1.02%、1.27%、1.74%、2.04%、1.48%、1.82%、2.64%，表明方法的重復(fù)性良好。

取同一供試品溶液，在常溫下，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24h后進(jìn)樣分析，計(jì)算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.80%、1.49%、1.32%、1.71%、2.33%、1.79%、1.72%、2.03%、2.38%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.5加樣回收率的試驗(yàn)

精密稱取含量已知的喘舒片樣品（批號：20191101）粉末6份，加入相當(dāng)于樣品含量100%的對照品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。

鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為99.62%、100.02%、99.84%、97.35%、98.38%、98.92%、100.23%、99.84%、97.74%，RSD分別為1.28%、1.61%、0.78%、1.02%、2.57%、1.80%、1.53%、1.29%、2.42%。

1.2.6樣品的含量測定

取6批喘舒片樣品，分別按“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，采用外標(biāo)法計(jì)算每片樣品中各待測組分的含量（表2）。

2討論

在喘舒片處方中，鹽酸克倫特羅屬微量成分（標(biāo)示量為每片10μg），黃芩提取物（以黃芩苷計(jì)）的理論含量為每片60mg，兩種組分含量的巨大差異讓同時(shí)測定兩者的含量比較困難。參考處方中部分待測組分的理論含量，并結(jié)合樣品分析圖譜中各待測組分的相對含量，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索，最終文中對照溶液的濃度，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，9種待測組分的含量均在擬合回歸方程的線性范圍內(nèi)。曾考察了不同濃度的甲醇溶液及甲醇-鹽酸（100∶1）作為溶劑的超聲提取效果。

結(jié)果表明：以甲醇-鹽酸（100∶1）為提取溶劑時(shí)，液相色譜圖譜雜質(zhì)峰增多，黃芩素色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰無法實(shí)現(xiàn)基線分離。黃芩苷色譜峰消失，黃芩苷為一元弱酸化合物，與酸堿作用具有多位反應(yīng)點(diǎn)，推測可能在酸性環(huán)境中發(fā)生了酸催化的水解反應(yīng)。以甲醇為提取溶劑，超聲提取30min，提取效果最好，色譜圖雜質(zhì)峰少，基線穩(wěn)定，9個(gè)目標(biāo)物與相鄰峰均能完全分離，分離度大于1.5。曾考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終選擇文中流動(dòng)相系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了9種待測成分和相鄰雜質(zhì)峰的良好分離。

采用HPLC-DAD在190～400nm掃描，結(jié)果顯示：鹽酸克侖特羅的最大吸收波長為245nm，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在220、278、318nm均有較大吸收，大黃粉中蒽醌類成分在254～265nm有較強(qiáng)的紫外吸收。

因此，文中采用245、278、254nm作為測定波長，可實(shí)現(xiàn)對供試品溶液中9種目標(biāo)物的良好分離，滿足方法學(xué)考察的要求。

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