氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，EC）是一種在動(dòng)物乃至人體內(nèi)具有潛在致癌性的2A類致癌物，存在于多種發(fā)酵食品及酒精飲料中，如醬油、奶酪、葡萄酒、黃酒等。研究表明，尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸和焦碳酸二乙酸是EC形成的前體物，其中酵母菌和部分乳酸菌通過(guò)精氨酸代謝途徑產(chǎn)生的尿素和瓜氨酸是最重要的2種前體物。

酒類的瓜氨酸主要自精氨酸脫亞胺酶途徑代謝產(chǎn)生，在這一途徑中包括3種關(guān)鍵酶，分別為精氨酸脫亞胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和氨基甲酸激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。該途徑將精氨酸水解，最終轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸、氨和二氧化碳。

目前關(guān)于鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的研究較少，主要集中在人體內(nèi)，由于是肝臟尿素循環(huán)的必需酶，因此OTC酶的缺失常導(dǎo)致嗜睡、嘔吐、精神發(fā)育遲緩等癥狀，同時(shí)OTC的缺失與否也可作為肝細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)之一。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，OTC與氨基甲酸乙酯的形成呈負(fù)相關(guān)性，即OTC的表達(dá)對(duì)EC的形成有抑制作用，然而OTC與EC的直接關(guān)聯(lián)性未見(jiàn)研究報(bào)道。

短乳桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在含碳水化合物的動(dòng)物、植物發(fā)酵產(chǎn)品以及溫血類動(dòng)物的消化系統(tǒng)中十分常見(jiàn)，作為一般認(rèn)為安全（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品級(jí)微生物，在食品、工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域中亦擁有重要的應(yīng)用價(jià)值。挖掘益生性乳酸菌源的酶類是目前人們的關(guān)注點(diǎn)之一。

本研究以短乳桿菌中的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶為對(duì)象，通過(guò)基因克隆表達(dá)手段和Ni-NTA純化方法，獲得大量高純度的OTC酶，在黃酒發(fā)酵的不同階段直接添加到酒體中，研究其與EC之間的相互作用，為挖掘其潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）和質(zhì)粒pET28a由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全試金公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鳥(niǎo)氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、硫酸卡那霉素（Kan），生工生物工程（上海）股份有限公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHＩ、SalＩ，TaKaRa公司；麥曲、酒藥，浙江塔牌黃酒公司。

1.2 方法

1.2.1 鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的克隆

短乳桿菌OTC酶的正向引物序列為：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下劃線為BamHＩ識(shí)別序列），反向引物序列為：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下劃線為SalＩ識(shí)別序列）。以短乳桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行純化。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶BamHＩ和SalＩ分別對(duì)短乳桿菌OTC基因片段和載體pET-28a進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含卡那霉素的LB平板上，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，篩選得到陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定目的基因序列。

1.2.3 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

挑取陽(yáng)性單菌落接種于5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接于200mL的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，至OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），于25℃，180r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集菌體后，加入30mL緩沖液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重懸菌體，隨后冰水浴超聲破碎細(xì)胞，于4℃，12000r/min離心20min，獲得上清液。參照Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂的使用說(shuō)明方法，采用親和層析純化重組蛋白，隨后利用SDSPAGE檢測(cè)蛋白純度及分子質(zhì)量。

1.2.4 黃酒釀造過(guò)程及試驗(yàn)處理方法

以0.8kg糯米為原料，30℃下浸米2d，高溫蒸煮后冷卻，加入160g麥曲和1.6g酒藥及0.96L水，攪拌均勻后于28℃發(fā)酵。以不作任何處理的自然發(fā)酵黃酒作為對(duì)照組（CK），在發(fā)酵第5天加入純化后的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（5D），在發(fā)酵第12天加入相同濃度的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（12D），分析比較發(fā)酵過(guò)程中EC及其相關(guān)代謝物的差異。

1.2.5 氨基甲酸乙酯的HPLC-FLD測(cè)定

測(cè)定方法參照Fu等[3]的報(bào)道，樣品與0.1mL，1.5mol/L鹽酸和0.2mL，0.01mol/L占噸醇正丙醇溶液衍生后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)。以甲醇和水作為流動(dòng)相，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)233nm，發(fā)射波長(zhǎng)600nm，梯度洗脫進(jìn)樣。

1.2.6 尿素、瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活的測(cè)定

尿素和瓜氨酸的檢測(cè)方法分別參照陳宜宜等和Boyde等的文獻(xiàn)所述，通過(guò)與顯色劑的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)發(fā)酵液中的含量。
取發(fā)酵液超聲15min破碎細(xì)胞，于4℃，12000r/min離心20min，取上清為原蛋白提取物。根據(jù)茚三酮顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定OTC酶活，蛋白含量則采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)中OTC酶活定義為每分鐘水解1mg蛋白質(zhì)產(chǎn)生1μmol鳥(niǎo)氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.2.7 黃酒基礎(chǔ)理化品質(zhì)的檢測(cè)分析

1.2.7.1 黃酒中游離氨基酸的含量測(cè)定

采用日本日立L-8900氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)原理為采用茚三酮作為衍生劑與氨基酸衍生后檢測(cè)分析。前處理方法為：取50mL黃酒樣品，加0.1mol/L鹽酸溶液超聲振蕩5min，加5%磺酸水楊酸去除蛋白，離心后采用氮吹儀濃縮，加0.02mol/L鹽酸2mL，振蕩后過(guò)膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

將8mL酒樣和0.2gNaCl加入頂空瓶中，50℃下磁力攪拌加熱15min后，將萃取頭插入頂空瓶中，繼續(xù)于50℃下加熱30min后進(jìn)樣。GC色譜條件：載氣為氮?dú)?，流速?mL/min，無(wú)分流進(jìn)樣；程序升溫：初始柱溫40℃，保持5min，以5℃/mL的速率升溫至230℃，保持10min。進(jìn)樣口溫度250℃，GC解析時(shí)間2.5min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EＩ）電子能量為70eV，離子源溫度250℃，接口溫度250℃，檢測(cè)口電壓為350V。掃描方式為全掃描，質(zhì)量范圍為35～350。

1.2.7.3 電子舌味覺(jué)分析

相對(duì)于感官鑒評(píng)方法，電子舌實(shí)現(xiàn)了酸、苦、澀、咸、鮮和甜味等基本味及回味的數(shù)字化評(píng)價(jià)，具有結(jié)果穩(wěn)定且受外界影響小的優(yōu)點(diǎn)。

取適量待測(cè)樣品置于電子舌測(cè)試杯中，對(duì)其酸、甜、苦、澀、咸、鮮等基本味及回味進(jìn)行測(cè)定，不同味覺(jué)與傳感器一一對(duì)應(yīng)，所有傳感器分別在參比溶液和黃酒樣品中浸泡、洗滌，測(cè)得電勢(shì)值Vr和Vs，通過(guò)對(duì)Vs-Vr值的計(jì)算，即可對(duì)黃酒的酸、甜、苦、澀、咸和鮮味等基本味和回味進(jìn)行分析。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試4～5次，為減少系統(tǒng)誤差，選后3次納入數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)值進(jìn)行差異顯著性分析。

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