天然的CLA主要存在于動物、植物、海產(chǎn)品中，如在牛、羊等反芻類動物的乳脂和肉制品中含量較高。c9，t11-CLA還被命名為瘤胃酸（ru-menicacid）。自上世紀50年代開始，人們接連在反芻動物的脂肪組織、烤牛肉中發(fā)現(xiàn)了CLA，并證實其抗癌功能。發(fā)酵乳是經(jīng)乳酸菌發(fā)酵動物乳而制成的，因獨特的滋味和特殊的營養(yǎng)價值而受到人們的喜愛。對發(fā)酵乳產(chǎn)品的檢測，包括感官評價、理化指標(biāo)、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌數(shù)等。對發(fā)酵乳發(fā)酵性能的檢測包括質(zhì)構(gòu)、流變、滋味、氣味、持水性等指標(biāo)。

目前，在原始發(fā)酵乳基礎(chǔ)上加入其它營養(yǎng)物質(zhì)，以提高發(fā)酵乳的營養(yǎng)特性、風(fēng)味特性和發(fā)酵特性的產(chǎn)品越來越多。加入益生菌的發(fā)酵乳營養(yǎng)更加豐富，攝入的益生菌在人體內(nèi)積累定植后，對改善宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡具有重要作用，益生菌乳制品同時還具有緩解乳糖不耐癥，抗高血壓，降低生殖道感染風(fēng)險，促進Ca²⁺吸收和維生素生成等功能。許多可生產(chǎn)CLA的菌株均為乳酸菌，可用于發(fā)酵。當(dāng)使用能生產(chǎn)CLA的菌株生產(chǎn)功能性乳制品時，便可將CLA較好地融入產(chǎn)品中，從而利于乳制品的多種有益功能。有研究發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)CLA的乳酸乳球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌復(fù)配后發(fā)酵牛奶，所得產(chǎn)物中CLA最大值為56.51mg/mL。目前大多CLA在食品中應(yīng)用較少，如何能獲得高產(chǎn)CLA的乳酸菌并應(yīng)用于發(fā)酵乳中，具有較大的意義。本研究從發(fā)酵乳中篩選菌株，得到產(chǎn)共軛亞油酸的菌株，將其直接用于制作發(fā)酵乳，研究該菌株的發(fā)酵性能，測定CLA的產(chǎn)量，評估發(fā)酵乳的綜合指標(biāo)，以獲得CLA含量高，品質(zhì)好的發(fā)酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳樣品和純牛奶采自內(nèi)蒙古呼和浩特和呼倫貝爾，采集后置于無菌容器，放于冰盒中帶回。革蘭氏染色液試劑盒，索萊寶科技有限公司（北京）；細菌DNA提取試劑盒，康為世紀生物科技有限公司（北京）；DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker，大連寶生物；2×EsTaqMasterMix（Dye）、6×SuperStainLoadingBuffer，北京康為世紀；溶菌酶，北京索萊寶；瓊脂糖，北京中科瑞泰生物；亞油酸（LA），90%純度，上海聯(lián)邁生物；共軛亞油酸標(biāo)準品（CLA），Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀（Eppendorf）、高速冷凍離心機（Ep-pendorf），德國Eppendorf公司；超微量核酸蛋白定量儀（ThermoFisher），ThermoFisher公司；質(zhì)構(gòu)儀（BROOKFIELD），美國BROOKFIELD；電子舌（In-sent），日本Insent。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的分離純化

發(fā)酵乳梯度稀釋后涂布MRS平板，37℃培養(yǎng)2d。挑取菌落狀態(tài)不同的透明和半透明單菌落，每個單菌落經(jīng)過3～4次劃線純化后，37℃，靜置培養(yǎng)24～48h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 革蘭氏染色鑒定

挑取待檢菌落于載玻片，滴入生理鹽水稀釋，固定后進行染色，具體操作見革蘭氏染色液試劑盒說明書，染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.3 CLA含量測定

選取CLA質(zhì)量濃度為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0μg/mL的樣品，測定吸光度值（λ=233nm），制作標(biāo)準曲線。選取革蘭氏染色陽性菌株接種MRS培養(yǎng)基（0.5mg/mLLA），37℃培養(yǎng)24～48h，加入正己烷充分振蕩，4℃，10000g離心10min，取上清液測定吸光度值（λ=233nm），根據(jù)標(biāo)準曲線計算生成CLA的含量。

1.3.4 16srDNA鑒定菌種

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取已篩選的乳酸菌基因組，稀釋基因組DNA至終質(zhì)量濃度為20ng/μL，以此為模板，用16s通用引物進行PCR擴增，PCR驗證結(jié)果呈陽性的菌株送交上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

1.3.5 單因素試驗

以發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性、滋味特性和CLA產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，研究植物乳桿菌HAC01接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH值、LA添加量，發(fā)酵結(jié)束后后熟時間對發(fā)酵性質(zhì)的影響。利用質(zhì)構(gòu)儀測定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指標(biāo)，測定條件及參數(shù)為：探針選擇直徑為2.5cm的平底圓柱形探針，測定模式選擇阻力測試，感應(yīng)力選擇自動感應(yīng)10g，測定前下降速度1.0mm/s，測定速率2.0mm/s，測定后速度8mm/s，進入樣品深度20mm，對測試樣品進行兩次壓縮，間隔時間5s。利用電子舌測定樣品的綜合味覺信息，指標(biāo)包括酸、甜、苦、咸、鮮。

1.3.6 均勻設(shè)計

使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V7.05進行均勻設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌分離純化

為得到具有較高CLA產(chǎn)量的菌株，本試驗從采集的發(fā)酵乳樣品分離純化菌種，利用菌落形態(tài)和革蘭氏染色進行初步鑒定，結(jié)果如表1所示，乳酸菌菌落形態(tài)基本呈半透明、圓形隆起狀，革蘭氏染色為陽性。

2.2 菌株CLA含量

測定篩選出的25株革蘭氏陽性菌的CLA產(chǎn)量，結(jié)果見圖1所示，其中產(chǎn)量最高的為7號菌株，CLA產(chǎn)量為（2.7197±0.0056）μg/mL，選取產(chǎn)量相對高的10株菌進行后續(xù)試驗；CLA標(biāo)準曲線如圖2所示，由標(biāo)準曲線得到回歸方程：Y=0.0741X+0.0032，線性相關(guān)系數(shù)R²=0.9991。

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