非脫羧勒克菌（Leclercia adcarboxglata）是一種廣泛存在于自然界中的腸桿菌科革蘭陰性兼性厭氧菌，與大腸桿菌有許多相同的生化特征，能引起免疫功能不全或有慢性疾病患者的感染，是多種微生物感染的病原體之一，與其他細(xì)菌共同引起較為嚴(yán)重的共感染。該菌是一種機(jī)會(huì)致病菌且與誘發(fā)因素有關(guān)，如創(chuàng)傷或免疫抑制等，可從血液、糞便、痰、尿、腹膜液和膿液中分離獲得。

β?內(nèi)酰胺類抗生素在過去70年被廣泛作為抗菌藥物，其耐藥現(xiàn)象可由多種機(jī)制引起，如產(chǎn)β?內(nèi)酰胺酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)、生物被膜機(jī)制、膜孔蛋白缺失以及與青霉素結(jié)合蛋白親和力下降等，其中β?內(nèi)酰胺酶水解或修飾β?內(nèi)酰胺類抗生素使其失活，使相應(yīng)菌株對幾乎所有β?內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性，質(zhì)粒攜帶β?內(nèi)酰胺耐藥基因是導(dǎo)致菌株耐藥性快速傳播的主要原因。非脫羧勒克菌對頭孢菌素、碳青霉烯類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、喹諾酮類和氯霉素敏感，近年來陸續(xù)報(bào)道了少量產(chǎn)超廣譜β?內(nèi)酰胺酶（extended?spectrumβ?lactamases,ESBL)和碳青霉烯酶的非脫羧勒克菌感染相關(guān)病例。現(xiàn)階段只有少量多藥耐藥（multi?drug resistant,MDR）的非脫羧勒克菌被報(bào)道，關(guān)于blaCTX?M的報(bào)道僅有2例。

本研究中，我們對來源于原南京軍區(qū)總醫(yī)院重癥急性胰腺炎患者血液樣本的菌株150707804和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌患者胃引流樣本的菌株P(guān)12375進(jìn)行了分析，旨在對其遺傳背景、耐藥表型進(jìn)行鑒定，通過高通量全基因組序列測定分析，結(jié)合生物信息學(xué)研究，對其攜帶耐藥基因的移動(dòng)元件和耐藥基因座位進(jìn)行精細(xì)注釋，揭示非脫羧勒克菌多重耐藥的傳播機(jī)制。

1 材料和方法

1.1菌株來源與鑒定

菌株150707804分離自47歲男性重癥急性胰腺炎患者血液樣本，菌株P(guān)12375分離自63歲男性胃癌患者引流液樣本。16S rDNA基因擴(kuò)增初步確定菌種。

1.2藥敏實(shí)驗(yàn)

使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對菌株150707804、P12375分別進(jìn)行藥敏MIC檢測，依據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2020標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果[20]。

1.3質(zhì)粒測序及組裝

使用Qiagen公司的Ultra Clean®Microbial DNA Isolation kit(CAT.12224?250）試劑盒，分別從分離株150707804和P12375中提取基因組DNA。構(gòu)建均值約15 kb(10～20 kb）的DNA文庫，通過PacBio RSII測序平臺(tái)進(jìn)行“三代”高通量基因組測序。同時(shí)，構(gòu)建均值約400 bp(150～600 bp）的雙端測序（paired?end）文庫，利用HiSeq“二代”測序平臺(tái)上機(jī)測序。通過Proovread[21]軟件用短雙端測序讀長（paired?end reads）校正PacBio長reads，校正過的PacBio reads通過HGAP v3.0（基因組覆蓋率100×）進(jìn)行拼接組裝，最終獲得野生株完整基因組全序。

1.4生物信息學(xué)分析

以復(fù)制子repA正向序列起始密碼子的第一個(gè)堿基作為整個(gè)質(zhì)粒的“+1”位點(diǎn)，首先采用RAST 2.0初步預(yù)測質(zhì)粒的開放閱讀框（open reading frame,ORF），結(jié)合BLASTP/BLASTN、RefSeq數(shù)據(jù)庫和Conserved Domains數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ORF和假基因的逐個(gè)功能分析。利用在線數(shù)據(jù)庫ResFinder和CARD對耐藥基因進(jìn)行注釋，ISfinder、INTEGRALL和Tn Number Registry分別對插入序列、整合子、轉(zhuǎn)座子等結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋。用Inkscape 1.0繪制質(zhì)粒整體結(jié)構(gòu)圖、質(zhì)粒近源結(jié)構(gòu)比較圖和耐藥基因座位精細(xì)結(jié)構(gòu)比較圖。

1.5序列登錄號

兩株菌進(jìn)行全基因組測序后，得到質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM序列，提交至Gen?Bank，登錄號分別為MN823992和MN821366。

2 結(jié)果

2.1菌株鑒定及耐藥基因篩查

菌株150707804和P12375經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增初步鑒定，全基因組DNA序列與非脫羧勒克菌USDA?ARS?USMARC?60222（登錄號：NZ＿CP013990）進(jìn)行平均核苷酸一致性（average nucleotide identity,ANI）比對，結(jié)果菌株150707804為98.66%、菌株P(guān)12375為98.72%，最終核定兩株菌均為非脫羧勒克菌。

2.2藥敏測定結(jié)果

野生株150707804對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、喹諾酮類、單環(huán)β?內(nèi)酰胺類及呋喃類抗生素耐藥，對氨基糖苷類和磺胺類抗生素敏感；野生株P(guān)12375對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、單環(huán)β?內(nèi)酰胺類及呋喃類抗生素耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮和磺胺類抗生素敏感（表1），其中，喹諾酮類和呋喃類耐藥表型不同，可能原因：(1)喹諾酮類抗生素的主要作用靶點(diǎn)為DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，使細(xì)菌DNA不能形成超螺旋。質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM無喹諾酮類耐藥基因，其對應(yīng)染色體上也不含有耐藥基因，但菌株150707804和P12375的其他質(zhì)粒中分別含有qnrA、aac(6′）Ib-cr和qnrS、aac(6')Ib-cr。P12375對喹諾酮類抗生素敏感可能是由于耐藥基因突變不表達(dá)所致；(2)呋喃類抗生素主要由對氧不敏感的硝基還原酶基因（nfsA和nfsB）突變失活引起，干擾氧化還原酶從而阻斷細(xì)菌的正常糖代謝。質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM不含呋喃類耐藥基因，且菌株150707804和P12375的其他質(zhì)粒及染色體上也不含該類耐藥基因，可能是由于外排泵等其他耐藥機(jī)制引起表型差異，并不屬于本研究的范圍。

2.3質(zhì)?；蚪M序列測定及生物信息學(xué)分析

2.3.1質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM的基本特征

p707804?CTXM和pP12375?CTXM大小分別為110.2和116.7 kb（圖1，表2）。兩個(gè)質(zhì)粒全序高度相似（覆蓋度75%、核苷酸同源性98.69%），均包含保守骨架區(qū)（覆蓋度85%、核苷酸同源性98.69%）和外源插入?yún)^(qū)。

2.3.2質(zhì)粒骨架區(qū)

質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM骨架區(qū)總長度分別為84.3和85.8 kb（圖2）。二者均由質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)區(qū)（plasmid replication）、質(zhì)粒穩(wěn)定相關(guān)區(qū)（plasmid maintenance）以及質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)（conjugal transfer）組成。兩個(gè)質(zhì)粒有一定保守性，它們含有相同的復(fù)制子repA，為同一類型質(zhì)粒；含相同的質(zhì)粒穩(wěn)定相關(guān)基因parA、stbAB等；接合轉(zhuǎn)移區(qū)均含tra和pil兩個(gè)基因簇。同時(shí)，這兩個(gè)質(zhì)粒也存在差異性：(1)pP12375?CTXM中orf531被MDR區(qū)分割為兩部分，而在p707804?CTXM中orf531完整；(2)兩質(zhì)粒orf531至parA間差異性較大，有大片段的序列置換；(3)p707804?CTXM的orf516與pP12375?CTXM的orf927存在基因置換；(4)接合轉(zhuǎn)移區(qū)內(nèi)p707804?CTXM的orf774、orf234與pP12375?CTXM的orf1890存在基因置換。

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