2.3.3質(zhì)粒外源插入?yún)^(qū)

p707804?CTXM和pP12375?CTXM均只含一個MDR區(qū)。p707804?CTXM中Tn6810為新型轉(zhuǎn)座子，包含β?內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX?M?3、blaOXA?1和blaTEM?1，氨基糖苷類耐藥基因aacA4，氯霉素耐藥基因catB3，利福平耐藥基因arr3以及磺胺類耐藥基因sul1。

Tn6810（圖3）由Tn3家族的Tn1696進(jìn)化而來，為Tn1696的衍生物，插入在質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)區(qū)與穩(wěn)定相關(guān)區(qū)的基因間隙中，其兩端為同源重組形成的5 bp正向重復(fù)序列（direct repeat;target site duplication,DR)ATACA。Tn1696是Tn3家族Tn21亞群的單元轉(zhuǎn)座子（unit transposon），由1型整合子In4插入至res（重組位點，resolution site）位點形成，其結(jié)構(gòu)為：IRL(inverted repeat left,5'端反向重復(fù)序列）?tnpA（轉(zhuǎn)座酶基因）?tnpR（解離酶基因）?res?mer（汞抗性位點）?IRR(inverted repeat right,3'端反向重復(fù)序列）[22]。相較Tn1696,Tn6810有兩點明顯不同：(1)IRL被插入序列IS4321R打斷成兩段；(2)In1684替代了Tn1696的In4。

In1684為簡單1型整合子（concise class 1 inte?gron），包含5'?CS、基因盒（gene cassette array,GCA）和3'?CS，基因盒為aacA4-blaOXA?1-catB3-arr3，分別為氨基糖苷類、β?內(nèi)酰胺類、氯霉素和利福平耐藥基因（圖3）。Tn6320插入至3'?CS的qacED1中，使In1684被打斷，兩端形成5 bp DR(TAATC）；同時Tn6502插入至blaTEM?1下游介導(dǎo)blaCTX?M?3轉(zhuǎn)移。

pP12375?CTXM的MDR區(qū)插入至orf531，把orf531打斷，形成兩端5 bp DRs(AACTA），其由Tn6322（含汞抗性位點，mer locus）、ISKpn25、IS1R、In609、IS26以及ΔISPa38構(gòu)成（圖4）。In609為復(fù)合1型整合子（complex class 1 integron），包括5'?CS、VR1(variable region，可變區(qū)）/GCA、VR2和3'?CS,VR1為基因盒：gcuD2-aacA4′-17（氨基糖苷類耐藥基因）-gcuE14-catB8（利福平耐藥基因），VR2為ISCR1及其下游的blaCTX?M?9。

3 討論

目前，產(chǎn)ESBL菌株的出現(xiàn)已較為普遍，移動元件包括質(zhì)粒攜帶β?內(nèi)酰胺耐藥基因是主要原因。其中β?內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX?M通常存在于IncF、IncI、IncN、IncHI2和IncL/M等質(zhì)粒中，由插入序列ISEcp1或ISCR1介導(dǎo)，形成如Tn6502(ISEcp1-blaCTX?M?3-orf477）或Tn6503(ISEcp1-blaCTX?M?14-IS903D）轉(zhuǎn)座單元，在blaCTX?M和其他ESBL基因轉(zhuǎn)座過程中扮演重要角色，在相同或不同種屬的腸桿菌科細(xì)菌間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移和傳播。ISEcp1屬于IS1380家族，與普通的插入序列不同，ISEcp1為單末端插入序列，僅靠單個插入序列即可介導(dǎo)其下游鄰近的耐藥基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而大大提高了耐藥基因轉(zhuǎn)移的概率。ISCR通過滾環(huán)復(fù)制，導(dǎo)致含有相鄰耐藥基因的環(huán)形DNA分子形成，從而插入到其他位置，常見的為插入到1型整合子3'?CS下游形成VR2區(qū)。

非脫羧勒克菌中的blaCTX?M并不多見，目前關(guān)于攜帶blaCTX?M?3/blaCTX?M?9的非脫羧勒克菌，美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)(https：//www.ncbi.nlm.nih gov/search/）中僅有3例，如2012年韓國報道了攜帶blaCTX?M?3和blaTEM?1的菌株（登錄號：JX129230）但并未測得基因組全序；本研究室前期已發(fā)現(xiàn)1株攜帶blaCTX?M?9的IncR型質(zhì)粒（登錄號：MK036885）的非脫羧勒克菌，以及收集了1株攜帶blaCTX?M?3的勒克屬菌株119287（登錄號：CP046445）。

箭頭表示基因，不同顏色代表不同的基因功能分類；陰影部分表示同源區(qū)域；核苷酸同源性>95%

本研究中，pP12375?CTMX的MDR區(qū)內(nèi)，blaCTX?M?9由ISCR1介導(dǎo)，插入至整合子的3'?CS，其與本研究室前期發(fā)現(xiàn)的攜帶blaCTX?M?9的p16005813C(IncR）質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)極為相似（圖4）。菌株16005813分離自寧波李惠利醫(yī)院呼吸內(nèi)科患者痰液標(biāo)本，這兩株菌來自不同省份、pP12375?CTXM與p16005813C質(zhì)粒類型不同卻攜帶較為相似的移動元件，其主要差異有：(1)p16005813C中MDR區(qū)總長較長：不僅骨架部分較長，且外源插入也較多，相較pP12375?CTXM，增多了ΔTn9、ISKpn25以及其他6個IS;(2)pP12375?CTXM中無IS26?tet(A）?IS26 unit，僅存在單個IS26。Tn6810中，blaCTX?M?3由ISEcp1介導(dǎo)，通過識別其自身的IR和Tn6502下游另外一個與IRR?1序列高度相似的IRR?2(5'?TTAATGAATTGGGG?3'）介導(dǎo)Tn6502整體在細(xì)菌間的傳播。

攜帶blaCTX?M等多種耐藥基因的質(zhì)粒p707804?CTXM和pP12375?CTXM分別介導(dǎo)非脫羧勒克菌150707804和P12375對青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β?內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。p707804?CTXM為攜帶blaCTX?M?3的首個非脫羧勒克菌測序質(zhì)粒，表明這兩個質(zhì)粒分別是該耐藥菌攜帶多種耐藥基因的重要載體，是耐藥菌傳播和擴散的基礎(chǔ)，為闡明非脫羧勒克菌多重耐藥機制提供了更多依據(jù)。

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