1.3.5 重復(fù)片段基因指紋分析

以細(xì)菌基因組DNA為模板，參考Silva等的方法，利用設(shè)計(jì)的BOX引物（引物序列見(jiàn)表2）進(jìn)行rep-PCR擴(kuò)增。待擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并在UＶ燈下觀察電泳結(jié)果。

1.3.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將校正并拼接后的序列在GenBank中進(jìn)行同源序列的搜索，由rep-PCR得到的大致條帶情況，從差異估計(jì)出發(fā)，采用層次UPGMA法（UnweightedPair-GroupMeanAverage），根據(jù)供試菌株的rep-PCR擴(kuò)增條帶的大小，采用二進(jìn)制方法，生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.7 質(zhì)粒提取

將產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株過(guò)夜培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGAbio-tek，上海），根據(jù)試劑盒上的介紹對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取好的質(zhì)粒DNA在1.5%的瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳并在UＶ燈下觀察電泳結(jié)果。

1.3.8 細(xì)菌素粗提

1.3.8.1 硫酸銨鹽析沉淀法

按1%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)好的產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌接種到250mL的BHI液體培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)至少12h。將上述過(guò)夜培養(yǎng)好的菌液于4℃，10000r/min離心條件下離心25min，在上清液中添加45%的飽和硫酸銨攪拌溶解，置于4℃過(guò)夜。將過(guò)夜的溶液在10000r/min條件下離心30min，將沉淀溶解于5mL磷酸鹽緩沖液PBS（pH6.86）中，即得到細(xì)菌素粗提物。

1.3.8.2 凝膠過(guò)濾層析

以SephadexG-25為凝膠填料，超純水進(jìn)行預(yù)洗脫后再用PBS洗脫柱子，細(xì)菌素粗提物5mL上樣，流速0.5mL/min，先使用PBS進(jìn)行洗脫，之后用0.2，0.5mol/L的氯化鈉（NaCl）依次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。分別對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（吸取2μL粗提物抑制蠟樣芽孢桿菌），將有抑菌效果的洗脫液進(jìn)行凍干濃縮后復(fù)溶于pH6.86的PBS中置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE電泳（Ｔricine-SDS-PAGE）

參考Schagger等的方法，將凍干濃縮好的細(xì)菌素粗提純物質(zhì)在ＴricineSDS-PAGE進(jìn)行電泳。其中膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為夾層膠10%，濃縮膠4%，分離膠16.5%。采用分子質(zhì)量3.3～20.1ku的肽Marker（Solarbio）作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行染色脫色，將電泳膠在Bio-rad成像系統(tǒng)下記錄結(jié)果。

1.3.10 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

將產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株在30℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液在10000r/min條件下離心30min，取上清液加熱15min處理后，參考Sun等的方法，將上清液通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。利用現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學(xué)信息庫(kù)（Omicsbean）對(duì)獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選及鑒定

從牡蠣中初步篩選出的對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌有抑菌活性的菌株有14株（命名為O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2）。這些細(xì)菌在平板上具有典型的芽孢桿菌形態(tài)，即菌體扁平、粗糙不透明、邊緣不整齊、微黃色，且革蘭氏染色后結(jié)果均呈陽(yáng)性。這14株菌對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌譜見(jiàn)表3。其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2等菌株具有廣譜抑菌性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）、植物乳桿菌（L.plantanrum）等革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑菌效果，而且對(duì)弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii）、副溶血性弧菌（V.parahemolyticus）、大腸桿菌（E.coli）、腸道沙門(mén)氏菌（S.enterica）、福氏志賀氏菌（Shigellaflexneri）等革蘭氏陰性菌也具有很好的抑制作用。另外，由表3還可以看出，菌株18、19、26、27具有相似的抑菌譜，菌株F1、F2、F4、Y1、Y2等抑菌能力也十分相似。

將具有抑菌活性的細(xì)菌送檢測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這14株指標(biāo)菌株與芽孢桿菌屬同源性最高，均高達(dá)99%以上，可初步判斷其均屬于芽孢桿菌屬。其中，O為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens），18、19、26、27以及F1、F2、F4、Y1和Y2等菌株均為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），4、6、S分別為短小芽孢桿菌（B.pumilus）、廈門(mén)芽孢桿菌（B.xiamenensis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus），4-1為死亡谷芽孢桿菌（B.vallismortis）。

2.2 細(xì)菌素對(duì)熱和酶的穩(wěn)定性測(cè)試

細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)除了細(xì)菌素外，還可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、抗生素和H2O2等其它具有抑菌活性的物質(zhì)。為了排除其它干擾因素，通過(guò)加熱處理和酶處理方式確定抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。篩選出的14株菌在加熱后保持較好的抑菌活性。此外，經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理的平板點(diǎn)菌處抑菌圈不完整，這一結(jié)果說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)是熱穩(wěn)定性強(qiáng)的細(xì)菌素。

2.3 重復(fù)片段基因指紋分析（rep-PCR）和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

為了確定同一種屬的細(xì)菌基因型是否一致，本試驗(yàn)通過(guò)利用特殊設(shè)計(jì)的引物即BOX引物對(duì)抑菌譜相似且鑒定結(jié)果相似的菌株的DNA進(jìn)行rep-PCR擴(kuò)增，確定其相應(yīng)的基因圖譜，以便進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。Rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，18、26、27的擴(kuò)增產(chǎn)物基因圖譜基本一致，即重復(fù)片段基本一致，可以初步判斷為一種菌；F1、F2、F4、Y1、Y2等菌株的基因圖譜也呈現(xiàn)出一致性，可判斷為同一種菌；4-1與F1、F2、F4、Y1、Y2的rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在＜1.0kb相似，但在＞1.0kb處條帶略有不同，初步判斷是同屬但不同種的菌；O、S、4、6、4-1的條帶各不相同，可以判斷為同一種屬的不同菌。

根據(jù)rep-PCR擴(kuò)增條帶結(jié)果，采用二進(jìn)制方法，利用UPGMA軟件構(gòu)建得到相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖2）。結(jié)果顯示菌株Y1、F4、Y2、F2、F1的同源性較高，另外，菌株18、26、27位于一個(gè)分支簇，該結(jié)果與rep-PCR結(jié)果一致。鑒于rep-PCR基因指紋圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，結(jié)合芽孢桿菌抑菌譜范圍，可以初步判斷O、19、F和4-1與其它細(xì)菌不同，因此后續(xù)將選用這4株產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.4 質(zhì)粒提取

細(xì)菌素是通過(guò)核糖體合成產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。通常情況下細(xì)菌素通過(guò)在染色體上編碼產(chǎn)生，也可以通過(guò)質(zhì)粒產(chǎn)生，也有一些細(xì)菌素的合成是受染色體和質(zhì)粒的雙重調(diào)控產(chǎn)生。為了確定上述細(xì)菌素產(chǎn)生的位置，本試驗(yàn)通過(guò)提取質(zhì)粒中DNA，初步判斷編碼細(xì)菌素的基因是否位于質(zhì)粒，以便于進(jìn)一步對(duì)編碼細(xì)菌素的基因序列或者結(jié)構(gòu)分析提供依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4株細(xì)菌未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒。這一結(jié)果說(shuō)明這些芽孢桿菌主要是通過(guò)染色體上的編碼基因產(chǎn)生細(xì)菌素。

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