2.5 細菌素粗提

硫酸銨提取得到的細菌素粗提物對蠟樣芽孢桿菌有明顯的抑菌效果。用PBS和0.2mol/LNaCl溶液洗脫經(jīng)硫酸銨得到的細菌素粗提物并分別收集其洗脫液然后凍干。經(jīng)抑菌試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PBS和0.2mol/LNaCl洗脫的組分可以較好地抑制蠟樣芽孢桿菌（圖3）。

2.6 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖4是產(chǎn)細菌素芽孢桿菌的Ｔricine-SDSPAGE電泳結(jié)果。由于Ｔricine-SDS-PAGE電泳可以較好地分離＜30ku的蛋白，因此選用3.3～20.1ku的標準蛋白做對照。與Marker條帶對比可知菌株O在14.4ku左右時有一條較為明顯的條帶。菌株19在8ku和18ku處有明顯的蛋白條帶。菌株F則在8ku處、14.4ku左右均出現(xiàn)明顯的條帶。菌株4-1在14.4ku左右時有一條蛋白條帶。4株芽孢桿菌的Ｔricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果可以初步判斷出其所產(chǎn)細菌素的分子質(zhì)量均小于20ku。該結(jié)果也表明這些菌株所產(chǎn)細菌素可能為熱穩(wěn)定性較好的II類小分子蛋白。

2.7 LC-MS/MS鑒定結(jié)果

表4為產(chǎn)細菌素芽孢桿菌的LC-MS/MS鑒定結(jié)果。結(jié)合Ｔricine-SDS-PAGE電泳試驗結(jié)果可以初步判斷菌株O所產(chǎn)細菌素可能為13ku大小的含有DUF1093結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、13.506ku大小的YlbF家族監(jiān)管蛋白及18.877ku的1型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶；菌株19產(chǎn)生的細菌素可能為8.969ku的假設(shè)蛋白CXF51_07005、16.871ku大小的SPBc2原噬菌體衍生的蛋白質(zhì)YolA以及18.001ku大小的假設(shè)蛋白BESＴ7613_2224；菌株F所產(chǎn)細菌素可能為分子質(zhì)量大小為8.089ku的假設(shè)蛋白C1Ｔ28_21195、13.011ku大小的降解酶（加氧酶）、15.786ku大小的holin家族蛋白質(zhì)以及分子質(zhì)量為17.082ku的SMI1/KNR4家族蛋白；菌株4-1產(chǎn)生的細菌素可能對應(yīng)為9.439ku的小分子質(zhì)量的酸溶性孢子蛋白Ｔlp或是分子質(zhì)量為22.529ku的3-己酮糖-6-磷酸合成酶。目前的結(jié)果與蛋白數(shù)據(jù)庫內(nèi)已編號的蛋白比較，沒有完全一致的蛋白相匹配，表明本研究中發(fā)現(xiàn)的細菌素不排除為新型細菌素的可能。細菌素進一步純化，氨基酸序列比對和產(chǎn)細菌素的細菌全基因組序列進行測序分析，從而準確判斷這4株芽孢桿菌所產(chǎn)細菌素是否為新型細菌素。

3 結(jié)論

本研究從福建牡蠣中分離篩選出14株對常見致病菌有抑菌活性的芽孢桿菌菌株，通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)這些芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌等革蘭氏陽性菌及弗氏檸檬酸桿菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌均有一定的抑菌作用。同時，這些芽孢桿菌產(chǎn)的細菌素具有熱穩(wěn)定性強、易被蛋白酶分解和由核糖體編碼合成產(chǎn)生細菌素等典型細菌素特征。根據(jù)14株菌的抑菌譜范圍和rep-PCR結(jié)果，初步判斷4種菌株可能不同于其它芽孢桿菌。因此，選取這4株菌O（解淀粉芽孢桿菌），4-1（死亡谷芽孢桿菌），19和F（枯草芽孢桿菌）進行下一步試驗。通過Ｔricine-SDSPAGE電泳試驗，這4株芽孢桿菌產(chǎn)的細菌素分子質(zhì)量均不大于20ku。說明上述4株細菌可能產(chǎn)II類乳酸菌細菌素。利用LC-MS/MS鑒定并比對現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示這4株芽孢桿菌所產(chǎn)細菌素未在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，細菌素進一步純化，氨基酸序列比對和產(chǎn)細菌素的細菌全基因組序列進行測序分析仍需在未來試驗中進行，從而準確確定這4株芽孢桿菌的細菌素性質(zhì)。

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